弥漫型胃癌免疫治疗的现状及研究进展*

雷慧君 吴妍 吕慧芳 陈小兵

1965年Lauren 根据组织学差异将胃癌分为两种亚型：肠型和弥漫型，因其简便性及明显的指导意义，Lauren 分型至今仍广泛应用于临床，成为胃癌最经典的分型之一。弥漫型胃癌的肿瘤细胞粘附性差，呈广泛浸润，很少或没有腺体形成，细胞通常为小圆形，散在或簇状排列，间质纤维增生明显[1]。

肠型及弥漫型胃癌在发生发展及预后方面存在显著的差异。弥漫型胃癌预后更差，发生腹膜转移的风险更高，更容易远处转移[2]。近年来胃癌的发病率一直在下降，但这主要归功于肠型胃癌的明显减少，而弥漫型胃癌呈稳定或上升趋势。目前，全身化疗在胃癌治疗中仍发挥主要作用，有荟萃分析显示肠型胃癌患者接受全身化疗后总生存期（overall survival，OS）明显改善，而弥漫型胃癌患者可能无法从中获益[3]。真正应用于胃癌临床治疗的靶向药物较少，且弥漫型胃癌HER-2 阳性率显著低于肠型胃癌（4.3%vs.23.6%）[4]，提示多数弥漫型胃癌患者无法接受曲妥珠单抗治疗。免疫治疗为弥漫型胃癌治疗带来了新希望，但弥漫型胃癌独特的肿瘤微环境也为免疫治疗带来困境与挑战。

1 弥漫型胃癌免疫治疗的困境

弥漫型胃癌具有独特的肿瘤微环境，细胞外基质重塑导致肿瘤基质结构致密、血管生成，基因组稳定导致的低肿瘤抗原表达，表现出“冷肿瘤”表型。

1.1 致密的肿瘤基质结构

全基因组分析提示，与肠型胃癌相比，弥漫型胃癌与细胞-基质相互作用和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分有关的基因表达发生了改变[5]，这与弥漫型胃癌间质纤维增生明显的病理特征相匹配。ECM 是肿瘤微环境基质的非细胞成分，癌症进展过程中ECM 的广泛重塑导致其密度和组成发生改变，使ECM 变得“僵硬”，造成一个乏氧的肿瘤微环境，在这一过程中同时存在如基质金属蛋白酶等因子的释放，促进了肿瘤血管生成，有助于癌症增殖、存活和侵袭、转移[6]。致密的肿瘤基质结构影响免疫细胞向肿瘤组织迁移，与低密度基质相比，高密度基质中T 细胞增殖显著降低[7]。同时高密度基质也是肿瘤对治疗原发耐药的原因之一，ECM“僵硬”阻碍了肿瘤内药物有效吸收和输送。

1.2 肿瘤抗原低表达

癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）[8]和亚洲癌症研究小组（Asian Cancer Research Group，ACRG）[9]在分子水平对胃癌患者进行了分层。TCGA 分型中20% 属于基因组稳定（genomically stable，GS）型，主要对应Lauren 弥漫型。其特点是Ras 同族体基因家族成员A（Ras homolog gene family member A，RhoA）突变或RHO 家族GTP 酶激活蛋白融合。另外，根据ACRG 分型，弥漫型胃癌大多属于微卫星稳定性/上皮-间质转化（microsatellite stable/epithelial-mesenchymal transition，MSS-EMT）亚型，特点是CDH1 基因表达缺失，较少的体细胞突变。无论是GS 亚型还是MSS-EMT 亚型都表现出免疫抑制性的肿瘤微环境，对免疫检查点抑制剂治疗反应较差。同样，弥漫型胃癌是免疫原性较差的肿瘤，肿瘤突变负荷低，新抗原很少。

CDH1 基因突变在弥漫型胃癌中常见，占散发性弥漫型胃癌的23%～33%，占遗传性弥漫型胃癌的50%[10]。本课题组前期的研究中已证实由CDH1 基因编码的E-钙黏着蛋白在细胞粘附中扮演重要角色，E-钙黏着蛋白的丢失有助于肿瘤进展和转移[11]。RHOA基因突变是弥漫型胃癌特有的，近期的研究发现致癌性RHOAY42C突变是弥漫型胃癌中最常见的RHOA突变，与弥漫型胃癌的不良预后相关[12]。RHOAY42C通常与CDH1 丢失同时发生，促进肌动蛋白/细胞骨架重排和黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）的活性，进一步激活YAP/TAZ，PI3K/AKT 和β-连环蛋白。CDH1、RHOA 突变基因的分析及其他突变基因的发现，有助于新抗原的鉴定以及弥漫型胃癌患者分层和干预，从而提高免疫治疗疗效。

1.3 免疫抑制的肿瘤微环境

在肿瘤微环境中募集更多的效应T 细胞是提高肿瘤免疫原性的重要步骤，但免疫抑制的肿瘤微环境可能导致这些效应T 细胞的功能减低，因此除了增加浸润细胞的数量外，效应T 细胞的再活化对于改善和维持免疫疗法的抗癌功效必不可少。关于弥漫型胃癌肿瘤浸润CD8+T 细胞的研究结果目前仍存在争议，Pernot 等[13]的研究证明，与肠型胃癌相比，弥漫型胃癌具有较少的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞、NK 细胞和Tregs，显示出“冷肿瘤”表型，与不良预后相关。Kim等[14]同样证实了弥漫型胃癌具有较少的肿瘤浸润淋巴细胞，且肿瘤细胞PD-L1 阳性率很低。然而也有研究表明弥漫型胃癌中观察到CD8+T 细胞聚集，但这些肿瘤浸润CD8+T 细胞表现出细胞因子减少、抗肿瘤活性下降的“耗竭型”[15]。这种争议可能是由于弥漫型胃癌的异质性导致的。进一步根据肿瘤微环境对弥漫型胃癌进行分层对于指导弥漫型胃癌的免疫治疗的选择具有现实意义。

2 弥漫型胃癌免疫治疗现状

2.1 免疫检查点抑制剂

免疫检查点抑制剂通过阻断T 细胞活化的共抑制信号通路来激活宿主的免疫系统以对抗恶性肿瘤，具有疗效持久、安全性更佳的特点。近年来，PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂已经在多种恶性肿瘤中获得了巨大成功。KEYNOTE-059 研究中pembrolizumab 单药治疗在三线及以后的晚期胃癌中显示出的抗肿瘤活性和安全性[16]，使得pembrolizumab 获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗三线及三线以后肿瘤表达PD-L1（CPS≥1）的复发性局部晚期或转移性胃或胃-食管交界腺癌。另外，PD-1 免疫检查点抑制剂是首个不限癌种的免疫疗法，被FDA 批准用于不可切除或转移性MSI-H/dMMR 实体瘤患者。在胃癌二线治疗临床研究中，免疫检查点抑制剂疗法表现出一定的抗肿瘤活性，但结果仍差强人意。pembrolizumab对比紫杉醇二线治疗晚期胃癌或胃-食管结合部癌的KEYNOTE-061 研究中，pembrolizumab 对比化疗在CPS≥1 的患者中并未观察到明显的生存优势，中位OS 分别为9.1 个月和8.3 个月，中位无进展生存期（progression-free survival，PFS）为1.5 个月和4.1 个月[17]。对于胃癌的一线治疗，CheckMate-649 研究是一项基于既往未经治疗的不可切除的胃及胃-食管结合部癌患者的随机、开放Ⅲ期临床研究，nivolumab 联合化疗组对比单纯化疗组在CPS≥5、CPS≥1 及全人群组中均观察到了PFS 及OS 的获益[18]。虽然成果令人瞩目，但免疫检查点抑制剂在弥漫型胃癌治疗上仍存在一定的局限性。与肠型胃癌相比，弥漫型胃癌肿瘤细胞及肿瘤浸润免疫细胞中观察到更低的PD-L1 表达率[19]。KEYNOTE-061 研究根据Lauren 分型对胃癌患者进行了亚组分析，显示弥漫型与肠型患者均能从免疫治疗中获益，但弥漫型胃癌（HR=0.88，95%CI：0.54~1.45）疗效不及肠型胃癌（HR=0.66，95%CI：0.40~1.11）[17]。然而，Kundel 等[20]通过对KEYNOTE-061、KEYNOTE-062 及ATTRACTION-2 的荟萃分析显示，免疫检查点抑制剂在弥漫型胃癌和肠型胃癌中疗效差异无统计学意义。免疫检查点疗法的发展使晚期胃癌患者有了新选择，但在治疗晚期弥漫型胃癌中的作用效果仍有待进一步确证。

2.2 肿瘤疫苗

肿瘤疫苗通过将肿瘤细胞、肿瘤相关抗原及肿瘤相关肽导入患者体内，诱导宿主主动特异性免疫来产生抗肿瘤作用。CEA 是胃癌常见过表达的免疫治疗靶标，研究发现将使用编码CEA 的重组腺相关病毒载体与免疫刺激佐剂结合使用的疫苗方案，可打破对弱免疫原性自身抗原的耐受性，提高抗肿瘤反应[21]。一项包含HLA-A24 结合肽疫苗的临床试验中，该疫苗包含新型的癌症睾丸抗原和抗血管生成肽（包括DEPDC1、URLC10、FoxM1、Kif20A 和VEGFR1），证实肽疫苗疗法是安全的，并有望在晚期胃癌患者中诱导特异性T 细胞反应[22]。目前尚无肿瘤疫苗用于弥漫型胃癌的亚组数据。肿瘤疫苗在抗肿瘤治疗中有其独特的优势，尤其是以肿瘤特异性新抗原为靶点的个体化新抗原疫苗。1）有效的肿瘤疫苗需要联合应用免疫佐剂，引发炎症反应，提高肿瘤免疫原性。2）对于个体化新抗原疫苗，由于靶向的是作为体细胞突变的新抗原，其具有更好的肿瘤特异性[23]。另外，肿瘤疫苗能够诱导强效和持久的CD4+和CD8+T 细胞免疫[24]。提示肿瘤疫苗可能是治疗低免疫原性、CD8+T 浸润少且功能低下的弥漫型胃癌的有效免疫疗法。然而，肿瘤疫苗应用于胃癌仍有许多亟待解决的问题，包括肿瘤特异性新抗原的鉴定、克服肿瘤的免疫微环境、优化肿瘤疫苗的给药剂量及途径等。

2.3 过继性T 细胞疗法

过继性T 细胞疗法通过将患者自身的T 细胞进行体外改造、扩增后回输至患者体内，发挥杀伤肿瘤细胞的作用。如CAR-T 细胞疗法是通过基因工程技术将抗原识别区和信号转导结构域组成的工程化融合受体（chimeric antigen receptor，CAR）表达于T 细胞表面，通过MHC 非限制性的方式对含有靶抗原的肿瘤细胞特异性识别并发挥细胞毒作用。抗CD19 CAR-T 已在化疗难治性血液肿瘤中血液肿瘤获得较好成果，被FDA 批准用于B 细胞白血病的治疗。然而，CAR-T 细胞疗法在胃癌治疗中仍处于起步阶段，目前的CAR-T 疗法均处于临床试验阶段，尚无已公开发表的结果。由于胃癌表面抗原表达的高度异质性，寻找理想的表面抗原是胃癌CAR-T 细胞疗法最重要的挑战之一。Claudin18.2（CLDN18.2）是一种胃特异性膜蛋白，在弥漫型胃癌中表达更高[25]。Jiang 等[26]利用杂交瘤和人源化技术scFv 作为靶向部分开发了CLDN18.2 特异性CAR-T 细胞，在CLDN18.2 阳性胃癌PDX 模型中观察到肿瘤部分或完全消除。目前已有3 项CLDN18.2 为靶标的CAR T 细胞Ⅰ期临床试验正在招募中，包括NCT03159819、NCT03874897和NCT04404595。另外，靶向前列腺干细胞抗原[27]的CAR-T 细胞及靶向Trop2/PD-L1 的双特异性CAR-T 细胞[28]等已在胃癌动物模型中被证明具有明显抗肿瘤活性。除此之外，CAR-T 疗法仍需克服的问题包括T 细胞归巢障碍难以定植于肿瘤靶组织，缺氧、免疫抑制的肿瘤微环境，T 细胞衰竭等。

3 免疫治疗时代弥漫型胃癌的治疗策略

3.1 筛选能够获益的患者

虽然相对于肠型胃癌来说弥漫型胃癌对免疫治疗反应不佳，但仍有少部分弥漫型胃癌患者应用免疫治疗疗效明显。因此，筛选出这部分人群对于弥漫型胃癌的治疗意义显著。MSI 状态被认为是免疫治疗疗效良好的预测指标，但弥漫型胃癌中MSI-H 或dMMR 的肿瘤占比少，开发新的生物标志物势在必行[14]。肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）≥10 个突变/Mb 被FDA 批准成为第二个不限癌种应用PD-1 抑制剂的适应证，但研究者提出不同癌种的TMB差异很大，目前仍难以制定通用的高TMB 定义，因此这项适应证仍存在较大争议[29]。另外，CPS<1 被证明不能从免疫治疗中获益，CPS≥5 的患者应用免疫治疗生存率更佳[18]。近期的研究还发现肿瘤浸润淋巴细胞、炎症T 细胞相关基因表达水平、EBV 病毒、肠道菌群等可能是预测胃癌免疫治疗疗效的潜在生物标记物，多种生物标志物联合评估是未来免疫治疗预测及预后的趋势[30,31]。Ge 等[32]基于蛋白质组学将弥漫型胃癌进一步分为三个亚型：PX1、PX2 和PX3。其中PX3 亚型DNA 突变数最多，富含免疫应答相关蛋白，预示可能从免疫治疗中获益，但仍需更详细的研究。对弥漫型胃癌患者进行分层是筛选免疫治疗目标人群下一个要解决的关键问题。总之，每例患者均应根据其遗传背景及免疫情况个体化用药，精准治疗仍是未来免疫治疗不变的方向。

3.2 联合疗法

肿瘤免疫逃逸是一个复杂的过程，任何单一的免疫疗法都很难做到治愈癌症。联合其他疗法可能将那些对免疫疗法原发耐药的“冷肿瘤”变成发炎的“热肿瘤”，可能是未来最大限度提高免疫疗法疗效的有效手段。

除了CheckMate-649 研究，ATTRACTION-4 研究在亚洲人群中同样证实了免疫联合化疗在胃癌中的疗效。这项随机、多中心的Ⅱ/Ⅲ期临床试验显示，在HER-2 阴性晚期胃癌一线治疗中，nivolumab+化疗组对比安慰剂+化疗组PFS 和ORR 明显改善，疗效更优且不良反应可控[33]。尽管已经取得了一定成功，但目前的方案通常只是在标准的化疗方案中简单增加免疫疗法，并未对治疗中用药剂量、途径、时机等进行优化。因此，进一步研究化疗及免疫治疗的相互作用机制，探索个体化治疗方案对于晚期胃癌治疗具有重要意义。

共抑制受体如LAG-3、TIGIT、TIM-3 等在T 细胞上表达，与PD-1 共同抑制T 细胞功能，使T 细胞功能失调[34]。与这些共抑制受体抑制剂联合应用是提高PD-1/PD-L1 抑制剂疗效的手段之一。目前部分联合疗法已进入Ⅱ期临床试验，用于治疗进展期胃癌及食管胃结合部癌，包括NCT02935634、NCT03662659和NCT04062656 等。原位肿瘤疫苗是直接将各种生物及化学制剂直接注射至肿瘤部位，使肿瘤自身成为抗原，启动抗肿瘤免疫，其优势在于可使抗肿瘤药物直接进入肿瘤微环境，克服了组织穿透性差的问题，并提高肿瘤免疫原性[35]。因此，肿瘤疫苗联合其他免疫疗法或许是弥漫型胃癌免疫治疗的新思路。

免疫联合靶向治疗是目前探索的方向之一。瑞戈非尼联合nivolumab 的Ⅰb 期临床试验入组了25例三线及三线以上治疗的晚期胃癌患者，中位PFS为5.6 个月（95%CI：2.7～10.4 个月），中位OS 为12.3个月（95%CI：5.3～未达到）[36]。对于难以从抗HER-2治疗中获益的弥漫型胃癌患者来说，免疫联合抗血管靶向治疗值得期待。小鼠模型中，靶向FAK 在肿瘤微环境中观察到了减少的纤维化和免疫抑制细胞数量，并且使先前无反应的小鼠模型对过继性T 细胞疗法和免疫检查点抑制剂产生反应[37]。多项FAK 抑制剂联合免疫治疗的临床试验正在进行中，为改善RHOA突变的弥漫型胃癌免疫治疗疗效带来可能。

研究显示，放疗24h 后发现PD-L1 表达上调，并诱导持续的炎症反应[38]。因此，辐射也被认为是一种免疫佐剂。有部分个案报道提示放疗联合免疫治疗在胃癌中的作用，然而目前尚无临床研究能够证明二者联用有更好的疗效。此外，鉴于放疗同时具有免疫刺激作用及免疫抑制作用，与免疫治疗联合时，放疗的模式及剂量仍需进一步探索[39]。

4 结语

免疫治疗已被广泛应用于临床，在胃癌中已获批三线及一线治疗，并且仍在探索更多的适应证。弥漫型胃癌由于细胞外基质重塑导致肿瘤基质结构致密、血管生成，基因组稳定导致的低肿瘤抗原表达，并表现出“冷肿瘤”表型，形成了独特的免疫微环境，在免疫治疗时代仍存在许多现实问题。然而随着对免疫治疗的进一步研究，继续探索新的筛选方法和治疗策略，有望更加充分认知这些困境、克服这些难题，将使更多的弥漫型胃癌患者获益，为这部分难治胃癌患者带来新希望。