牦牛PIK3CB基因克隆及其在卵泡发育过程中的表达研究

马鸿程，熊显荣，，王 晗，海 卓，闵星宇，李 键，

(1.西南民族大学 生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，四川 成都 610041；3.动物科学国家民委重点实验室，四川 成都 610041)

牦牛(Bosgrunniens)主要活动于我国海拔3 000 m以上的高原地区，其对低氧恶劣生存环境具有极强的适应性，是当地牧民生产生活资料的重要来源之一。然而牦牛产业发展相对缓慢，严重限制当地的经济发展速率，其主要原因在于牦牛性成熟时间晚、繁殖周期长，繁殖性能较普通黄牛低下[1]。因此，开展牦牛繁殖方面的研究对丰富我国遗传资源多样性以及提高当地牧民的生活水平具有重要的价值。

卵巢是雌性哺乳动物重要的生殖器官，其主要作用是支持卵泡发育以及卵母细胞的生长和成熟[2]。原始卵泡激活、发育以及排出优质卵母细胞是维持雌性牦牛生育力的必要条件[3]。研究发现，包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-AKT)信号通路在内的多种细胞内信号通路对卵巢相关活动具有重要调控作用[4]。PI3K是一种特异性催化磷脂酰肌醇脂物质的激酶，作为PI3K-AKT信号通路上游关键分子，其主要有ClassⅠ、ClassⅡ、ClassⅢ 3型同工酶，ClassⅠ又分为ⅠA和ⅠB 2个亚类[5-6]。目前，人们研究最广泛的是由调节亚单位p85与催化亚单位p110组成的ⅠA型异二聚体蛋白，其催化亚单位包括p110α、β、δ 3种，其中p110β由PIK3CB基因编码[7-8]。当相应的配体将酪氨酸激酶受体(RPTK)激活后，招募脂酶PI3K到细胞内膜下并将其激活，激活的PI3K通过磷酸化磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)产生第二信使磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)，与细胞内AKT及3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)等含有PH结构域的蛋白结合，促使PDK1磷酸化AKT蛋白的第308位苏氨酸(Ter)导致AKT的活化，此外mTORC2也能在473位丝氨酸(Ser)磷酸化AKT进而使其到达完全活化的状态，活化的AKT通过激活下游靶蛋白或者抑制下游靶蛋白活性，包括TSC2、FOXOs、P27及BAD等，进而调节细胞增殖、分化、存活及迁移等活动[9-10](图1)。研究发现，条件性敲除PI3K-AKT通路反向因子磷酸酶-张力蛋白同源物(PTEN)后，PI3K持续激活，使原始卵泡池中的卵泡过度激活，导致敲除小鼠卵巢早衰，证明该通路参与卵泡发育调控[11]。在关于PI3K催化亚基的研究中，李倩[12]发现，PI3K信号p110δ催化亚基在介导FSH及E2等外源性激素引起的小鼠卵泡发育中起重要作用，p110δ缺失后影响有腔卵泡中颗粒细胞的增殖分化；另有研究表明，PI3K催化亚单位p110β通过与细胞分裂周期蛋白42(Cell division cycle 42，Cdc42)结合，调节卵母细胞中PTEN的表达，从而调控小鼠原始卵泡的激活过程[13]。

目前，关于PIK3CB基因的研究主要集中在癌症方面[14-15]，在卵巢组织及其功能中的研究较少。而其作为PI3K的催化亚单位之一，是否参与牦牛生长期卵泡发育调控仍未知。因此，本研究以牦牛为对象进行PIK3CB基因CDS区序列扩增，分析其在各组织中的相对表达量，同时对处于不同发育阶段牦牛卵泡壁层颗粒细胞及卵母细胞中的表达规律进行检测及分析，为深入研究PIK3CB基因在PI3K-AKT信号通路介导的卵泡发育等方面的作用机制提供数据支撑。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

TRIzol Reagent 从美国Invitrogen公司购入；核酸助沉剂购自百泰克公司；PrimeScrptTMRT Reagent Kit 反转录试剂盒、pMD19-T载体的生产公司为TaKaRa；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒、2×Phanta®Max Master Mix(Dye Plus)由南京诺唯赞提供；胶回收试剂盒购自康宁生命科学有限公司；感受态细胞DH5α从天根生化科技有限公司购入；0.5%透明质酸酶(0.5 g透明质酸酶粉末、100 mL Medium199)及卵母细胞成熟液(OM培养液)从赛默飞购入。

1.2 样本采集及处理

牦牛各组织样本均从四川省广汉市屠宰场采集。3～5岁健康牦牛(雌性，n=6，随机分为3组，每一组2头牦牛组织样本混合为一个生物学重复)，屠宰后立即无菌采集卵巢、子宫、胃、小肠、肌肉、心脏、肝脏、脾、肺脏、肾脏10个组织，剪成约1 cm3的组织块，迅速装入提前编号的冻存管中，并投入液氮罐中带回实验室保存备用。

用加有双抗(80 mg/L青霉素和100 mg/L链霉素)的生理盐水将采集到的部分卵巢冲洗干净投入保温瓶(含25 ℃生理盐水、双抗)中于3 h内带回实验室。用37 ℃生理盐水(含双抗)将卵巢冲洗数遍，根据卵泡直径大小将卵泡分为大(≥7 mm)、中(3.0～6.9 mm)、小(≤2.9 mm)3组，用12号针头注射器抽取卵泡液置于90 mm平皿，在体视显微镜下按组收集卵丘-卵母细胞复合物(Cumulus-oocyte complex，COCs)，使用卵母细胞成熟液洗数遍后0.2%透明质酸酶脱颗粒分离出卵母细胞，每组15枚。各组卵泡液离心后得到卵泡壁颗粒细胞，用PBS洗涤数次后，-80 ℃保存备用。

1.3 总RNA提取及反转录

收集的各组卵母细胞严格按照Single Cell-to-CTTMKit试剂盒说明书合成cDNA，-20 ℃保存备用。按照TRIzol法说明书步骤提取牦牛各组织以及卵泡壁颗粒细胞总RNA，使用核酸浓度仪检测所提取RNA OD值和浓度后，按照TaKaRa公司PrimeScriptTMRT Reagent Kit反转录试剂盒说明书将范围在OD=1.8～2.0的RNA模板合成cDNA，保存于-20 ℃备用。

1.4 引物设计及合成

参考NCBI数据库所公布黄牛(Bostaurus)PIK3CB基因的mRNA序列(NM-001206047.1)及GAPDH基因mRNA序列(AC-000162.1)，利用NCBI在线工具包设计PCR扩增引物和荧光定量引物，并交由金斯瑞生物科技公司(南京)合成，序列见表1。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.5 牦牛PIK3CB基因扩增克隆

牦牛卵巢cDNA作为模板，PIK3CB基因扩增体系25 μL：12.5 μL Premix TaqTMDNA聚合酶，分别1 μL上、下游引物(10 μmol/L)，1 μL cDNA模板，ddH2O补足到25 μL。反应条件为95 ℃预变性(4 min)；95 ℃变性(45 s)，60 ℃退火(45 s)，72 ℃延伸(1 min)，30个循环；72 ℃延伸(7 min)，4 ℃保存。PCR扩增结果通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，将符合条件的目的条带使用胶回收试剂盒纯化回收，对目的产物经过连接转化后，筛选出至少3个阳性克隆。样品送上海生工生物工程有限公司(成都)测序。

1.6 牦牛PIK3CB基因生物信息学分析

使用NCBI中Blast以及OFR Finder工具包对测序得到的牦牛PIK3CB基因序列进行同源性以及开放阅读框分析，通过MEGA 7.0构建系统进化树。ExPASY在线软件Protparam、TMHMM、SignalP、ProtScale、SOPMA、SWISS-MODEL工具包分别对牦牛PIK3CB蛋白的理化性质、跨膜区、信号肽、疏水性、二级结构及三级结构进行预测分析；NCBI中在线程序CDD进行PIK3CB蛋白结构域预测。

1.7 牦牛PIK3CB基因组织表达谱分析

以GAPDH为内参基因，采用RT-qPCR方法检测PIK3CB基因在牦牛卵巢、子宫、胃、小肠、肌肉、肝脏、心脏、脾、肾脏、肺脏中的表达情况。检测前将所有组织cDNA模板浓度调整一致(40 ng/μL)，以保证数据准确。反应体系为15 μL：SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ7.5 μL，0.5 μL上游引物(10 μmol/L)，0.5 μL下游引物(10 μmol/L)，1 μL cDNA模板，5.5 μL ddH2O。反应条件为95 ℃预变性(4 min)；95 ℃变性(45 s)，60 ℃退火(1 min)，72 ℃延伸(1 min)，38个循环；72 ℃(7 min)。引物见表1，重复3次。

1.8 牦牛PIK3CB基因在卵泡发育过程中的表达

GAPDH作为内参基因，采用RT-qPCR方法检测不同大小牦牛卵泡壁颗粒细胞及卵母细胞中PIK3CB基因mRNA的表达。反应体系及反应条件同1.7。

1.9 数据分析

每组试验重复3次，荧光定量结果用2-ΔΔCt均一化处理，通过SPSS 18.0软件进行方差分析，ANOVA进行显著性差异分析。其中P>0.05、P<0.05、P<0.01分别为差异不显著、差异显著、差异极显著。

2 结果与分析

2.1 牦牛PIK3CB基因序列

牦牛PIK3CB基因经过RT-PCR法扩增，并通过1.5%琼脂糖凝胶电泳对扩增结果进行检测。结果得到如图2所示条带，与预期大小基本一致。筛出的阳性菌液测序后得到牦牛PIK3CB基因核苷酸序列3 326 bp，其中包括可编码1 070个氨基酸的CDS区3 213 bp。

2.2 PIK3CB基因核苷酸氨基酸比对

通过NCBI在线工具包对测定序列编码区与黄牛(NM-001206047.1)的PIK3CB基因编码区序列进行比对，结果二者同源性为99.8%，且测得序列编码区与黄牛编码区序列相比，有4处碱基发生突变，引起密码子发生变化(AAG→CAG、TCC→TCA、AGG→GGA、ACT→ACC)，其中第1,3个密码子改变导致第147,526位氨基酸变化由K→Q、R→G。与野牦牛(XM_005908937.1)编码区对应序列相比，同源性为99.9%，氨基酸序列无变化。

2.3 牦牛PIK3CB基因与其他物种同源性比对

使用NCBI在线工具包对所测核苷酸序列与黄牛(Bostaurus，NM-001206047.1)、野牦牛(BosmutusXM_005908937.1)、山羊(Caprahircus，XM_018049899.1)、人(Homosapiens，KJ891808.1)、大猩猩(Pantroglodytes，XM_003950204.3)、欧洲野猪(Susscrofa，XM_021069524.1)、小鼠(Musmusculus，XM_011242829.3)、骆驼(Camelus，XM_031443314.1)、原鸡(Gallusgallus，XM_015276908.2)、澳洲野犬(Canislupusdingo，XM_025449126.1)的PIK3CB对应核苷酸序列同源性进行比对。结果表明，测序所得牦牛PIK3CB基因序列与野牦牛和黄牛的同源性最高，分别为99.9%，99.8%；与山羊、欧洲野猪、骆驼的同源性也较高(图3)。表明PIK3CB基因在哺乳动物长期进化过程中具有较高的保守性。

利用MEGA 7.0对包括牦牛在内的12个物种PIK3CB基因CDS区进行遗传进化树构建分析。结果显示，牦牛与野牦牛、黄牛的亲缘关系最近，其次是山羊；同时与大猩猩、欧洲野猪、小鼠、人、骆驼和澳洲野犬形成一个分支；与原鸡的亲缘关系较远(图4)。

2.4 牦牛PIK3CB蛋白结构和功能预测

利用ExPASY在线工具包预测PIK3CB蛋白理化性质，结果表明，该蛋白原子总数为17 340，分子量为122.8 ku，分子式为C5537H8708N1458O1580S57。预计半衰期为30 h，脂肪族指数、不稳定指数、理论等电点及亲水性平均值分别为94.83，45.42，6.51和-0.205，因此推测牦牛PIK3CB蛋白为亲水酸性蛋白。PIK3CB蛋白共包含有20种氨基酸，出现频率较高的有Glu(8.4%)、Pro(8.2%)、Ser(8.0%)、Ale(7.5%)、Gly(7.0%)、Leu(7.0%)。所有氨基酸中带正电荷的残基总数(Arg+Lys)为128个，带负电荷的残基总数(Asp+Glu)为134个，由此知PIK3CB蛋白整体上带负电。

通过ProtScale在线进行亲疏水性预测，表明PIK3CB蛋白亲水性在第1 003，1 004位最大为2.722，第500位氨基酸最小为-2.678，且多数氨基酸的亲水性分值小于零，即具有亲水性，与理化性质分析结果一致。SignalP、TMHMM工具包信号肽、跨膜区分析预测，结果表明，该蛋白无信号肽、无跨膜结构。NCBI在线软件CDD工具包分析该蛋白结构域，预测得该蛋白共包含5个结构域，其中第42-117位氨基酸为P85结合域(ABD)，第180-288位氨基酸为Ras结合域(RBD)，第324-501位氨基酸为C2结构域，第532-702位氨基酸为Ⅰ型PI3K辅助结构域，第706-1 067位氨基酸为p110β催化结构域(图5)。牦牛PIK3CB蛋白二级结构预测显示，该蛋白含492个α-螺旋占45.98%，52个β-折叠占4.86%，365个无规卷曲占34.11%，161个延伸链占15.05%，可推测出，α-螺旋和无规卷曲为该蛋白二级结构主要组成原件，与该蛋白三级结构预测结果一致(图6)。

2.5 牦牛PIK3CB基因mRNA组织表达谱

利用RT-qPCR方法检测牦牛不同组织中PIK3CB基因mRNA的表达。结果显示，PIK3CBmRNA在所检测牦牛相关组织中均有表达，但各组织间表达量存在差异(图7)。其中，脾脏、子宫以及卵巢组织中表达量较高，显著高于小肠、肌肉、心脏、肾脏、肺脏、肝脏、胃组织(P<0.05)。

2.6 不同发育阶段牦牛卵泡中PIK3CB mRNA表达分析

以内参基因GAPDH作为参照，利用RT-qPCR方法检测不同发育阶段牦牛卵泡中壁颗粒细胞及卵母细胞PIK3CB基因的表达情况(图8)。结果显示，随着卵泡发育，壁颗粒细胞中PIK3CB基因mRNA表达量呈上升趋势，且大、中级别卵泡中的表达量极显著高于小卵泡中的表达量(P<0.01)(图8-A)；卵母细胞中PIK3CB基因 mRNA相对表达量整体随卵泡发育程度呈下降趋势，但各级别卵泡中的相对表达量差异不显著(P>0.05)(图8-B)。

3 讨论与结论

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)作为一种特异性催化磷脂酰肌醇脂物质的激酶，同蛋白激酶B(AKT)形成PI3K-AKT信号通路，直接或间接参与细胞增殖、迁移、黏附等生物学过程[16]。研究发现，PI3K-AKT信号通路参与雌性动物一系列生殖调控，包括卵子发生、原始卵泡激活、卵泡发育、卵母细胞减数分裂及早期胚胎发育过程[17-20]。PIK3CB是组成PI3K的催化亚基之一，由受体蛋白酪氨酸激酶(RPTK)激活[21]，在该通路相关调控中起着重要的作用。目前，牦牛PIK3CB基因结构功能及其在雌性生殖中的作用依旧未知。本试验首次克隆了牦牛PIK3CB基因，并对其结构功能进行了预测。与黄牛PIK3CB基因编码区相比，牦牛对应序列出现5处碱基突变，致使2处氨基酸位点发生改变，但这种突变的具体影响有待进一步研究。预测得到牦牛PIK3CB蛋白具有典型的ⅠA型PI3K结构域。其中ABD结构域与调节亚单位p85的iSH2结构域通过非常紧密的相互作用，结合形成异源二聚体蛋白PI3K，RBD结构域与Ras超家族GTP酶相互作用，发挥其相关功能，而C2结构域是Ca2+依赖性的膜靶向结构域，可结合包括磷脂、肌醇多磷酸酯及细胞内蛋白质在内的多种物质[22]；同时通过与NCBI上公布的多个物种进行CDS区同源性比对，发现牦牛与野牦牛(99.9%)和黄牛(99.8%)同源性较高，与进化树亲缘关系吻合，进一步表明PIK3CB催化亚单位在哺乳动物中具有较高的保守性。

组织表达谱的结果显示，PIK3CBmRNA广泛表达在牦牛各组织器官中。研究发现ClassⅠ型PI3K催化亚基中除了p110γ只在白细胞中特异性表达外，其余包括p110β在内的几种亚基均在全身各组织中广泛表达，并在细胞内信号通路中发挥作用[23]，这与本研究结果相近。PIK3CB在牦牛各组织中的相对表达量呈现不同程度的差异，尤其在脾脏、子宫及卵巢中高表达。研究表明p110β在免疫复合物激活中性粒细胞中起关键作用[24]，而免疫器官脾脏中存在大量的中性粒细胞，因此PIK3CB基因在脾脏中高表达可能与其参与免疫调节活动有关，此问题有待进一步验证。同时大量研究证明，PI3K信号通路在生殖活动中起重要作用，PIK3CB在子宫及卵巢中高表达提示其在PI3K信号通路介导的卵巢相关功能中扮演重要角色。

哺乳动物卵泡发育起始于胎儿时期，这是一个连续的、选择性的过程，直到初情期后部分卵泡开始逐渐成熟并排卵[25-26]。包括卵泡壁颗粒细胞在内的多种体细胞通过间隙连接，在各种激素、蛋白质、细胞因子及卵泡内外环境的共同调控下直接或间接的参与卵泡发育[27]。研究发现，PI3K信号通路参与啮齿动物卵泡颗粒细胞增殖分化过程调控，小鼠颗粒细胞在FSH刺激后AKT被磷酸化激活，并在颗粒细胞分化为排卵前表型时达到高峰[28]。当PTEN从颗粒细胞中敲除时，PI3K-AKT通路被过度激活导致结构性黄体溶解受到抑制，颗粒细胞增殖加强，卵泡生长并增加排卵率[29]。为了进一步探索PIK3CB参与的PI3K-AKT通路在牦牛生殖过程中的作用，本试验运用RT-qPCR方法对牦牛不同发育阶段卵泡中PIK3CB表达量进行了检测，结果表明，PIK3CBmRNA在牦牛大、中、小各级卵泡壁颗粒细胞及卵母细胞中均有表达。在颗粒细胞中，PIK3CB基因 mRNA表达量随卵泡发育呈上升趋势，且大、中级别卵泡中的表达量极显著高于小卵泡中的表达量(P< 0.01)。卵泡中颗粒细胞增殖分化是卵泡生长发育的必要前提[27]。Guillermet-Guibert等[30]研究表明，p110β通过被G蛋白偶联受体(GPCR)异源三聚体(Gβγ)激活来发挥其在PI3K-AKT信号转导中的作用。同时Law等[31]研究发现，G蛋白偶联受体(GPCR)激动剂促卵泡激素(FSH)促进蛋白激酶A(PKA)依赖性的胰岛素受体底物1(IRS1)在酪氨酸残基上的磷酸化，从而激活PI3K，使PI3K-AKT信号通路活化进而促进颗粒细胞分化。因此，推测在大、中级别卵泡中PIK3CBmRNA高表达是由于其诱导壁颗粒细胞增殖分化的能力增强，加快卵泡发育进程。在各级别卵泡卵母细胞中PIK3CB基因 mRNA同样均有表达，且整体随卵泡发育程度呈下降趋势，但其相对表达量差异不显著(P>0.05)。研究证实卵母细胞内的PI3K信号对原始卵泡的存活和激活是必不可少的[11-13]，但在生长期卵泡中并不是必需的，当PTEN[18]及PDK1[32]从生长期卵泡的卵母细胞中敲除时，卵泡发育、排卵、卵母细胞成熟和生育力均没有发生改变。因此，推测卵母细胞中PIK3CB表达是由于在原始卵泡激活过程中mRNA的储存，而对激活后生长期卵泡的发育，颗粒细胞中的PIK3CB比卵母细胞内的PIK3CB更重要。综上所述，PIK3CB基因参与诱导颗粒细胞增殖，其对卵泡发育过程至关重要。

本试验克隆获得了牦牛PIK3CB基因序列，其在哺乳动物进化过程中高度保守。PIK3CB基因mRNA在牦牛不同大小级别卵泡壁颗粒细胞及卵母细胞中均有表达，其中颗粒细胞在中、大卵泡中高表达，卵母细胞在各级别卵泡中的表达差异不显著。表明PIK3CB基因参与PI3K-AKT介导的卵泡发育调控，是PI3K信号通路在调节颗粒细胞的功能中不可或缺的催化亚基之一，具体调控机制有待进一步研究。本研究为深入探讨PI3K-AKT信号通路在卵巢发育中的调控机理提供基础资料。