内盖夫西门坎菌的研究现状与展望

卢思敏，袁 帅，吴移谋

1993年内盖夫西门坎菌(Simkanianegevensis, Sn)作为细胞培养污染物首次被发现。与衣原体一致，Sn亦为专性胞内寄生菌，具有独特的二相性发育周期。大量研究表明Sn与婴儿细支气管炎[1]、成人社区获得性肺炎(community acquired pneumonia, CAP)[2]和慢性阻塞性肺疾病急性加重(Acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease, AECOPD)[3]等呼吸道疾病的发生和发展密切相关，于1999年被正式命名。西门坎菌科主要包括西门坎菌属(Simkania)、弗里契菌属(CandidatusFritschea)和海龙原体属(CandidatusSyngnamydia)3个属[4]。西门坎菌属目前仅有Sn一个菌种，模式株ATCC VR1471亦称为ZT株。本文对Sn的生物学特征、致病性和致病机制以及实验室诊断的研究现状进行综述。

1 生物学特征

1.1形态与结构 Sn在宿主细胞内生长繁殖，具有独特的二相性发育周期，可观察到两种主要形态结构：一种形态小而致密，直径为0.2～0.3 μm，存在于胞外环境中，具有感染能力，类似于衣原体的原体(Elementary body, EB)；另一种形态大而疏松，直径为0.3～0.7 μm，位于胞内，以二分裂方式繁殖，类似于衣原体的网状体(Reticulate body, RB)。与其它衣原体不同的是，Sn的EB颗粒除有拟核区域外，还有电子透明区域的存在；其RB形态多样，且可能具有类似于EB的感染能力[5]。

与其它衣原体菌株相比，Sn在含病原菌的囊泡结构上也存在很大差异。西门坎菌囊泡(Simkania-containing vacuole, SnCV)是一种单个网状液泡系统，与宿主内质网、线粒体、吞噬溶酶体等细胞器相互作用影响自身的生长与发育[6-7]。有趣的是，在感染早期SnCV表面可检测到自噬标记物LC3的存在，但随着感染持续，SnCV表面的LC3逐渐消失，相关机制有待进一步阐述[6]。此外，Herweg等对SnCV的蛋白组成进行分析时发现SnCV在Sn营养获取过程中发挥重要作用[8]。

1.2培养特性 Sn对多种细胞敏感，可在各种细胞系中繁殖，如BGM、HeLa、Vero、McCoy、HL和人成纤维细胞等。提高培养基中胎牛血清浓度、在培养基中加入放线菌酮以及使用二乙氨基-葡聚糖(DEAE-dextran)或聚乙烯二醇等化学制剂预处理宿主细胞等常规用来提高衣原体感染率的处理均不利于Sn的增殖。将接种有Sn的Vero细胞在35 ℃、1 500 g条件下离心60 min后培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基是目前研究者推荐的相对有效的培养方法。此外，在分离培养临床样本中的Sn时应注意在培养基中添加100 μg/mL的链霉素和万古霉素[9]。Sn在Vero细胞中生长缓慢，生长周期大约12～15 d，显著长于其它衣原体典型菌株的周期。生长曲线显示，Sn在感染细胞后的2～4 d呈对数生长，随后进入稳定期。与衣原体不同，Sn似乎并不以诱导细胞裂解的方式释放子代，可以检测到Sn感染性子代数量不断增加，却未观察到子代感染邻近细胞的现象，其相关机制还需进一步深入研究[5, 10]。

1.3生化特征 衣原体是一类严格真核细胞内寄生的原核细胞型微生物，需依赖宿主细胞的营养和能量来合成自身高分子蛋白质、核酸及低分子叶酸、赖氨酸等营养物质而繁殖。然而，Sn在生化特征上与衣原体并不完全一致。

Sn含有葡萄糖激酶，能够直接通过糖酵解途径将葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖，从而减少对宿主细胞磷酸化葡萄糖的依赖。除进行完整的糖酵解途径外，其菌体内还含有三羧酸循环乌头酸水合酶(Aconitine hydratase，AcnB)、异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate dehydrogenase, Icd)和柠檬酸合酶(Citrate Synthase, GItA)，可通过糖酵解途径后丙酮酸产生的乙酰辅酶A或富马酸中天冬酰胺的转化开始柠檬酸循环，独立产生NADH和ATP。与其它衣原体相似，Sn无法从头合成核苷酸，必须依赖核苷酸转运蛋白从宿主摄取核苷酸。目前，已经在Sn中鉴定出4种核苷酸转运蛋白亚型：SnSTT1(一种ADP/ATP反向转运蛋白)、SnSTT2(一种鸟嘌呤/ATP/H+共运输体)、SnSTT3(一种三磷酸核苷酸逆向转运蛋白)和SnSTT4(功能未知)。此外，Sn具有较为完整的氨基酸、叶酸合成途径。色氨酸是衣原体发育的重要调控因子，宿主固有免疫应答可通过干扰素γ(Interferon-γ，IFN-γ)诱导色氨酸降解从而抑制衣原体生长，使其进入一种“暂停发育”状态。除能合成酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸外，Sn还拥有完整的色氨酸操纵子(tryptophan operon, trp)。因此，Sn对IFN-γ的敏感性可能远低于衣原体[4, 11]。

1.4基因组结构与功能 作为西门坎菌属的代表菌株，Sn首先被完成测序(NC_015713)，其基因组结构与其它衣原体存在一定的差异性(表1)。Sn基因组全长2 496 337 bp，G+C含量为38 mol%,预测其91%的基因组为编码序列，其中含有2 519个蛋白编码基因、35个tRNA基因和1个rRNA操纵子，此操纵子含有3个rRNAs (5S，16S，23S)，另有一个大小为132 038 bp的质粒。其16S rRNA编码基因(GenBank登录号为U68460)与衣原体同源性为83%，与立克次体同源性为73%[12]。

迄今为止，细菌中除贝纳柯克斯体(Coxiellaburnetii)外，仅在Sn中检测到了Ⅰ型内含子的存在。该菌Ⅰ型内含子与藻类及变形虫的叶绿体、线粒体的23S rRNA内含子密切相关。SnⅠ型内含子并不是由23S rRNA剪接而来，有可能是通过基因水平转移的方式获得。目前，该菌Ⅰ型内含子的具体功能还不明确，但有证据表明其可能通过抑制核糖体的功能影响菌体发育。Ⅰ型内含子的存在可能与阿米巴虫和植物质体存在共同进化史[4]。

表1 几种衣原体基因组的主要特征Tab.1 Main characteristics of several Chlamydiae genomes

1.5抗原结构 Sn与衣原体在形态上相似，但在抗原结构上不同。Sn有大量特异性蛋白质，但绝大多数(69%～82%)是未鉴定功能的未知蛋白质[13]。

衣原体主要外膜蛋白(major outer membrane protein, MOMP)的二级结构与穿孔蛋白(porin)一致，具有穿孔蛋白特性。外膜蛋白A(outer membrane protein A, OmcA)、外膜蛋白B(outer membrane protein B, OmcB)同MOMP一起构成外膜复合物。除参与衣原体入侵外，外膜蛋白还是诱发宿主免疫应答的主要抗原[14]。

经蛋白组学分析，Sn外膜主要由65种外膜蛋白组成，其中，有37种外膜蛋白类似衣原体MOMP，称为MOMP样蛋白；有30种外膜蛋白含有β-折叠结构，可能发挥类似穿孔蛋白样作用。Sn中尚未检测到OmcA、OmcB及其同系物的存在[15]。此外，Sn还存在3种多形态膜蛋白B(polymorphic membrane proteins B, PmpB)的同系物，与衣原体Pmp一样，同系物中存在前导序列、C-末端自转运蛋白域及典型的GG[A/L/V/I][I/L/V/Y]…FXXN序列，可能具有分子转运、黏附、信号转导或其它相关功能[16]。

2 致病性与致病机制

2.1致病性 西门坎菌是一种广泛分布于全世界的新发衣原体。弗里契菌属中已鉴定的两个弗里契衣原体种均寄生在昆虫体内，是烟粉虱和介壳虫的专性共生菌；海龙原体属则都能对鱼类致病，引起鱼类上皮组织囊肿[17-18]。Sn则是一种阿米巴共生体，能广泛寄生于节肢动物、哺乳动物细胞和阿米巴虫等各种生物[13,19]。Sn及其变异株都能感染人体，但确切的传播途径尚未阐明。Croxatto和Donati等研究者相继从节肢动物蜱中扩增出了Sn DNA和在胃肠道疾病患者中检测到了针对Sn的特异性IgA抗体，这表明人类可能通过接触携带病原菌的阿米巴虫、节肢动物或饮用被其污染的水而被感染[4]。患者感染Sn后出现高热、干咳、白细胞计数左移和胃肠道不适等类似CAP的临床表现且对红霉素治疗有反应[2]。一项关于索罗亚医疗中心婴儿细支气管炎的前瞻性研究发现，参与研究的239名细支气管炎患儿中，有25%的个体检测到了Sn，并在15%的个体中检测到了特异性IgA的存在，这说明Sn可能在婴儿细支气管炎中发挥致病作用[1]。此外，有血清学结果分析显示，Sn还可能与AECOPD存在联系。

体外研究证实Sn能感染各种组织来源的人类细胞培养物，如呼吸道上皮细胞、生殖道细胞、胃肠道细胞和内皮细胞，并显著黏附于呼吸道上皮细胞和生殖道细胞[20]。在培养细胞中Sn可引起以下3种感染：①急性感染，感染过程中感染性子代数量不断增加并伴随明显的细胞病变效应和炎症因子分泌。②持续性感染，其发生可能与Sn抑制细胞凋亡和缺乏诱导细胞裂解的能力密切相关。感染过程伴随着炎症因子分泌，但尚未引起明显的细胞病变效应。持续性感染细胞与巨噬细胞型细胞共培养后可转化为急性感染。③潜伏性感染，该种感染可能由铁降解诱导产生，在感染过程中没有引起感染性子代数量增加和明显的细胞病变效应，但能检测到Sn DNA的存在和炎症因子分泌。在连续性胰蛋白酶处理后，潜伏性感染可转化为急性感染[4, 20]。

2.2致病机制 Sn质粒(PSn)是目前已知衣原体质粒中最大的质粒，与编码138种预测蛋白的F型接合质粒高度相似[13]。Kari等[21]和Porcella等[22]分别在2011年和2015年利用该菌质粒缺陷株进行体内和体外感染实验发现，与野生株相比，缺陷株引起的感染和炎症反应程度较弱，PSn有可能像衣原体质粒一样，在Sn致病机制中发挥重要作用。衣原体的巨噬细胞感染增强蛋白(macrophage infectivity potentiator， MIP)是一种相对分子量为27 kDa的脂蛋白，具有肽基脯氨酰顺/反异构酶(PPIase)活性，与嗜肺军团菌表面的MIP具有较高的同源性。其中，沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis, Ct)MIP可通过TLR2/TLR1/TLR6及CD14途径刺激感染细胞分泌IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8等促炎细胞因子，引发严重的炎症反应，加重组织损伤[23]。已经证实，PSn能够编码产生MIP同系物，其可能通过多种途径影响Sn与宿主细胞的相互作用过程从而促进病原体致病，但具体机制尚不明确[13]。巨噬细胞是固有免疫反应的主要细胞，在衣原体感染人体后可通过吞噬-溶酶体途径灭活并消化病原体[24]，但部分致病衣原体可通过多种机制逃避巨噬细胞杀伤并存活于巨噬细胞内，如Ct可通过挤压体的形成促进其在巨噬细胞内的存活并增强自身感染性[25]。体外研究表明，Sn能够在单核细胞/巨噬细胞系U937细胞中存活，且能以U937细胞作为媒介感染其它组织来源的贴壁细胞，虽然相关机制还不清楚，但这些初步实验结果可能与Sn在体内的感染情况相关，应进一步研究[26]。

除PSn外，Ⅲ型分泌系统也可能在Sn致病过程中发挥重要作用。Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system，T3SS)是广泛存在于动、植物致病菌中的一种蛋白质传输系统，通过分泌效应蛋白或将毒力蛋白注入宿主细胞发挥致病作用。衣原体的不同发育时期，T3SS可通过发挥不同作用以营造适合衣原体寄生的微环境。如Ct TarP蛋白(Ct456)可通过调节肌动蛋白募集反应促进EB入侵宿主细胞[27]。He等[28]通过研究表明，除影响鹦鹉热衣原体生长发育外，T3SS还可通过活化JNK/ERK途径诱导宿主细胞分泌IL-8、IL-6、TNF-α和IL-1β等促炎因子。基因组分析显示，Sn含有与衣原体科成员均相同的T3SS编码基因，其编码的T3SS可能在Sn抑制宿主细胞免疫反应过程中发挥重要作用，但其具体机制有待进一步阐明。

此外,Sn抑制TNF-α诱导细胞凋亡的能力、编码产生的MOMP样蛋白及分泌的金属肽酶等也可能在其致病过程中发挥重要作用[10, 29]。

3 实验室诊断

目前，针对Sn感染的检测方法有3种，分别是病原体的分离与培养、血清学诊断和基因诊断。但尚未有标准方法对Sn感染进行诊断。

3.1分离与培养 Sn不能在人工培养基上生长，只能寄生在活细胞内。细胞分离培养是其主要的分离培养方法。细胞培养除用作Sn分离外，还可研究其繁殖过程及其对细胞的敏感性和传染性。但细胞培养过程极易被痰、鼻咽拭子等标本中的其它细菌污染，其敏感性显著低于聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)[30]。现主要采用Vero细胞分离培养临床标本中的Sn。分离培养过程中发现，Sn与衣原体一样，对克林霉素、四环素类、大环内酯类和利福平类抗生素敏感，但对部分细胞壁抑制剂具有抵抗性，如青霉素、万古霉素[31]。除细胞分离培养外，阿米巴虫分离Sn也是一种有效分离方法。值得注意的是，虽然绝大多数阿米巴虫都能维持新发衣原体的生长，但并非所有的阿米巴虫都敏感于Sn。现主要采用棘阿米巴虫分离样本中的Sn。目前有研究者指出使用一种以上的棘阿米巴虫或几种阿米巴虫可提高临床样本中衣原体的分离率[30]。

3.2血清学诊断 血清学检测是临床应用最为广泛的一种检测方法，主要包括酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)、免疫过氧化物酶试验(Immunoperoxidase assay, IPA)和微量免疫荧光试验(Microimmunofluorescence assay, MIF)。其中，ELISA是目前检测Sn感染最常见的血清学试验，对Sn既往感染、近期感染以及急性感染的鉴定均具有一定意义。Friedman等[32]以梯度纯化的Sn颗粒作为抗原对血清学标本进行ELISA分析后表明：ELISA对筛选Sn既往感染比较有效，但并不适用于检测幼童血清中的IgA。与ELISA将梯度纯化的Sn颗粒作为抗原进行抗体检测不同，IPA在检测过程中将感染细胞和未感染细胞的混合物作为抗原，在光学显微镜下通过比较检测标本与阴阳对照得出结果。经对比发现，IPA适用于检测任何年龄阶段的血清标本[1]。MIF是衣原体感染血清学检测的金标准，但似乎并不具备检测Sn特异性抗体的能力。为了对比实验室间关于Sn感染的检测结果，通常将IgG≥1∶64判定为既往感染，IgM≥1∶32或急性期与恢复期之间IgG效价增高4倍以上判定为急性感染[30, 33]。

3.3基因诊断 随着PCR技术的不断发展，其在衣原体学领域的应用越来越广泛。Kahane[1]在1998年首次采用针对该菌16SrDNA序列的引物ZpF和ZpR扩增出了一个大小为398 bp的DNA片段。随后，Vouga等[7]通过该菌特异性16SrRNA基因运用定量PCR技术实现了对该菌DNA的定量检测，并利用引物16SF和16SR及探针扩增出一个长为125 bp的片段。除16SrDNA序列外，目前用于构建Sn PCR引物的DNA有23S rRNA基因序列及该菌热休克蛋白60(Heat shock protein 60，Hsp60)基因序列等[30, 34]，具体引物序列见表2。

表2 内盖夫西门坎菌常见PCR引物Tab.2 Common PCR Primers of Simkania negevensis

4 展 望

Sn作为一种新型衣原体，其发现丰富了衣原体的生态多样性，开辟了新的研究领域。随着全基因组测序的完成，人们对Sn的一般生物学特征有了初步认识。但由于标准化研究方法的缺乏，人们对Sn的致病作用知之甚少。进一步开发针对Sn研究的标准化方法、开展与已知衣原体的对比研究工作将会深化我们对Sn的了解、丰富我们对衣原体的认知，为全面开展衣原体临床诊断和防治工作夯实基础。

利益冲突：无