六神曲酶活性研究进展△

范亚楠，陈彦琳，杜杰，钟荣荣，孙晓丛，周旭，王奕博

中国中药有限公司，北京 100195

六神曲又名神曲、六曲，最早收载于《药性论》[1]，为面粉、麦麸、苦杏仁、赤小豆、青蒿、辣蓼及苍耳草混合后经发酵而成的曲剂[2]，其富含维生素B 复合体、消化酶、挥发油、麦角固醇、苷类和黄酮类等活性物质。六神曲主要具有健脾和胃、消食调中等功效[3]，临床多用于饮食停滞、脾胃虚弱、小儿积食及胸痞腹胀的治疗，应用广泛。

按照现代微生物学的观点，六神曲的发酵本质上是基质和环境中携带的微生物在适宜环境下进行的生物代谢。根据以往研究结果，这些微生物主要为酵母菌、真菌、细菌。微生物为了分解基质，生成自身营养物质，产生木质素酶、纤维素酶、淀粉酶、脂肪以及蛋白酶等多种胞内酶系和胞外酶系。这些酶类可以将基质的成分分解转化，形成新的成分。六神曲原料并没有消食的功效，而在发酵后具备了健脾消食的作用，说明药效作用是由发酵产生，药效物质为微生物在代谢过程中产生的酶或者代谢产物，这就是六神曲发酵炮制的理论依据[4]。六神曲中主要含有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、糖化酶、麦芽低聚糖酶[5]等，可将六神曲基质中的淀粉、蛋白质分解为单糖、低聚糖、氨基酸、小肽，微生物进行物质代谢产生的长链脂肪酸类成分也是协助胃肠道行使正常功能，预防胃炎和胃肠道溃疡的主要成分[6-11]。由于酶的活性大小决定代谢物产生的多少，因此，对于酶活性的监测可有效评价发酵的程度。本文主要从酶活性检测方法及酶活性研究方法对六神曲的研究进行归纳，旨在为六神曲的深入研究及开发利用提供参考。

1 六神曲酶活性概况

1.1 淀粉酶

淀粉酶是分解淀粉糖苷键一类酶的总称，有α-淀粉酶、γ-淀粉酶、麦芽低聚糖酶等多种酶。

1.1.1α-淀粉酶α-淀粉酶主要作用是水解淀粉分子链的α-1，4-葡萄糖苷键，切断成寡糖、短链糊精及少量葡萄糖和麦芽糖，使淀粉黏度迅速下降，从而达到“液化”目的。因此，α-淀粉酶又称液化酶，但其不能作用于支链淀粉。产生此酶的微生物主要有细菌、真菌及基因工程菌等[12]。细菌包括枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌，真菌主要是青霉菌、曲霉菌，青霉菌大多为黄青霉，曲霉菌主要包括米曲霉、黑曲霉、烟曲霉。

淀粉酶的测定方法在实际应用中可大致分为2 种，一种方法原理是利用二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该反应产物在高温条件下显现棕红色，且在一定浓度范围内其颜色深浅与还原糖含量成正比，可以用比色法测定还原糖含量，如DNS 测定法；另一种方法是利用直链淀粉和支链淀粉遇碘显色不同，α-淀粉酶的水解活性液中直链淀粉和碘反应形成蓝色络合物，支链淀粉遇碘则呈现紫红色。在直链淀粉聚合度降低到一定程度时，其与碘的复合物呈红棕色。在酶底物反应终止后，可以通过测定其吸光度确定α-淀粉酶水解淀粉的程度，如碘法。经查阅文献发现，最早的六神曲淀粉酶活性研究始于1977年，检测方法为次亚碘酸定糖法[13]；2004 年，高慧等[14]首次运用碘-淀粉比色法测定淀粉酶活性；2012年，王海洋等[15]引入DNS 测定法测定淀粉酶活性；碘-淀粉比色法及DNS测定法一直延续至今。

1.1.2γ-淀粉酶γ-淀粉酶又称糖化酶。γ-淀粉酶能从淀粉的非还原端水解支链淀粉和长链淀粉，水解产物为葡萄糖。产生此酶的微生物为蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、假单胞菌等[16]。

γ-淀粉酶测定方法近年来研究的也较多[17-19]，依据其作用原理大致可分成3 类：测定淀粉水解后的还原产物；测定淀粉的消耗量；色素测定法。其中前2 种方法与α-淀粉酶测定方法原理基本一致，但在实际应用中，γ-淀粉酶的测定方法在六神曲中使用较广泛的是DNS比色法，该方法反应较灵敏。

1.1.3 麦芽低聚糖酶 麦芽低聚糖酶是淀粉酶的一种，其酶解产物麦芽低聚糖具有抑制肠道有害菌生长的作用。产生此酶的微生物为嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等[20]。

目前，麦芽低聚糖酶活力的测定尚无国家部颁标准，中外文献资料也未见报道。刘建军等[21]依据部颁标准γ-淀粉酶的测定方法，制定了麦芽低聚糖酶活力的测定方法。

1.2 蛋白酶

蛋白酶是六神曲中主要消化酶之一，其可以切断蛋白质分子的肽键，使其变成小分子的氨基酸和多肽。产生此酶的微生物主要为枯草芽孢杆菌及曲霉等。

蛋白酶的测定方法多采用福林酚法[22]，福林酚法又称福林法。福林酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色（钼蓝和钨蓝混合物），由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），可使蛋白质及其水解产物在碱性条件下被还原成蓝色（钼蓝和钨蓝混合物）。

1.3 其他

1.3.1 纤维素酶 纤维素酶（CMC）是一种复合酶，是催化β-1，4-葡萄糖苷键水解的一种酶，经酶类共同作用，将纤维素降解为葡萄糖和纤维二糖。其主要由葡聚糖内切酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶3种主要成分组成，滤纸酶（FPA）活力测定法是一种通用的较为经典的测定纤维素酶综合活力的方法[23-25]，其反映了3 类酶组分的协同作用，统称FPA 活性。产生纤维素酶的主要是根霉、黑曲霉和木霉等。

FPA 和CMC 的酶活力接近，这可能与药效成分的抽出和植物破壁有关[26]。测定方法为分别以1% CMC 溶液和whatman NO.1 滤纸为底物，采用DNS比色法测定CMC和FPA的活力。

1.3.2 脂肪酶 脂肪酶可以催化油脂分解为甘油、脂肪酸及甘油单脂或二脂，且能分解或合成高级脂肪酸，并具有多种催化能力，可催化不溶性酯类的醇解、水解、转酯化、酯化及酯类的逆向合成反应。产生此酶的主要是类酵母、假丝酵母和米根霉等。

脂肪酶活测定方法为以16.5 mmol·L-1对硝基苯磷酸二钠（pNPP）溶液为底物，采用pNPP 法测定脂肪酶活力[27]。

2 六神曲酶活性研究进展

2.1 用于比较六神曲不同炮制品差异

有研究者采用碘量法对自制六神曲样品进行淀粉酶活力测定，结果表明，六神曲生品中的淀粉酶活力比炮制品要高，而炒后蛋白酶活力显著升高；在改善胃肠动力药效学实验方面，生品、制品均能提升病理模型小鼠的小肠推进功能，且生品优于制品[3]。

2.2 用于优化六神曲工艺

2.2.1 用于优化六神曲处方 刘腾飞等[28]采用DNS法测定糖化酶及淀粉酶含量，综合糖化酶、淀粉酶及蛋白酶指标优选神曲配料比为麸面比70∶30，碳氮比100∶2。高慧等[14]按碘-淀粉比色法对实验室自制六神曲中淀粉酶活性进行测定，发现不同面粉、麦麸配比的样品淀粉酶活力有差异，蛋白酶活力、薄层色谱未见显著差异。考虑到曲料的黏性、拌曲的难易程度及原料的经济性，选面粉∶麦麸=25∶75为最佳配比。此结果与刘腾飞等[28]研究的麸面比结果几乎吻合。王丽芳等[29]采用相同方法测定淀粉酶活性，结果显示，无论是在28 ℃还是33 ℃下发酵，鲜品组淀粉酶及脂肪酶活力峰值都明显高于干品组，组间差异有统计学意义。其中，鲜品煎汁组略高于鲜品榨汁组，六神曲用鲜品组方入药优于干品组。

除此之外，戚岑聪等[30]在六神曲发酵过程的质量监测中运用近红外光谱分析技术，结果表明，运用近红外光谱技术对蛋白酶、淀粉酶活力进行定量分析，和传统的分析方法所得结果之间具有较好的相关性。而且，建立的模型在全面粉发酵组与麦麸面粉比例1∶1 发酵组中均有较好的适用性，可以考虑将模型进一步推广。

2.2.2 用于优化六神曲发酵工艺 徐云等[26]运用DNS 比色法发现，发酵过程中产生的消化酶存在一定变化规律：纤维素酶、淀粉酶及脂肪酶的活力在发酵4 d时达到峰值，糖化酶活力在发酵第三天时达到峰值，而后4 种酶活力都有下降的趋势并逐渐趋于平稳；而蛋白酶活力在发酵前4 d 并没有显著变化，且随着发酵时间的延长蛋白酶活力显著升高。因此，最终确定六神曲的发酵工艺时间为4～6 d。张红玲等[31]采用碘-淀粉比色法研究了由四川辅正药业公司提供的8批六神曲自制发酵品（发酵天数为8 d，每天取样），结果发现，糖化酶及淀粉酶活力在4 d达到最高值，而蛋白酶活力在第五天达到最高值，并选六神曲发酵第四天的样品进行药理实验，发现其对小鼠胃肠运动有显著影响，因此，六神曲最佳发酵时间为4 d 左右。刘腾飞等[32]采用DNS 比色法，按照《全国中药炮制规范》的方法制备六神曲，考察在赤小豆加入量、发酵时间及发酵温度单因素的基础上，运用Box-Behnken响应面设计试验，筛选出最佳发酵工艺参数为赤小豆加入量2.6 g·（100 g）-1、发酵温度为32 ℃、发酵时间3 d。王海洋等[15]按照《全国中药炮制规范》制备六神曲，采用相同方法对淀粉酶活力进行测定，结果发现，发酵温度控制在30～37 ℃时，最佳发酵时间为7 d；赤小豆的最佳处理方法为煮烂拌曲；青蒿、辣蓼、苍耳草的最佳添加方式为以鲜品水煎液混合均匀后拌曲，发酵后六神曲的淀粉酶活力明显高于市售的2 种六神曲样品。刘晓瑜等[33]采用福林酚法测定蛋白酶活力，综合蛋白酶、淀粉酶的活力和高效液相色谱法（HPLC）特征图谱，结果发现，六神曲最佳发酵的相对湿度为80%，中药汁加入量为0.65 mL·g-1。

2.3 用于筛选六神曲发酵菌种

邬吉野等[2]运用碘-淀粉比色法检测酶活性发现，六神曲原料中不含淀粉酶、蛋白酶，而黄曲霉纯种发酵能显著升高六神曲中2 种酶的酶活力。有研究者采用相同方法测定淀粉酶活性[34]，研究发现，毛霉菌可以提高按照传统工艺制作的六神曲样品中淀粉酶及蛋白酶活力，因此，认为毛霉菌为进行六神曲纯种发酵的最优菌种。程亦雄等[35]则采用福林法测定蛋白酶活力，发现分离得到的赛氏曲霉菌落质地绿色呈绒毛状，表面附有黄色渗出物，在发酵过程伴有轻微的酸性气味散出，且产蛋白酶的活性明显优于淀粉酶活性，因此，认为赛氏曲霉菌落可作为优选菌种进行发酵实验。

2.4 用于比较六神曲不同工艺差异

六神曲的制作工艺各地药品标准要求不一，其差异主要体现在原料配比与生产条件上。王云庭等[5]首次以麦芽低聚糖酶活力为考察指标，比较不同产地六神曲样品中生品、制品的麦芽低聚糖酶活力，结果发现，六神曲不同产地的麦芽低聚糖酶活力有显著差异。其中，生品六神曲酶活力最高的为广西，最低的为四川，同一产地的六神曲样品生品酶活力大于炮制品。张鹏等[36]收集了6个不同产地六神曲市售样品，采用碘-淀粉比色法发现，不同产地六神曲样品淀粉酶活力差异显著，为200～500 U，范围跨度较大。

3 展望

六神曲是临床常用中药饮片，但仍未被《中华人民共和国药典》2020 年版收载。部颁标准也只收载了其组方配比及制作方式，同时仅凭外观和经验来评价质量。经过文献调研发现，六神曲的生产来源不尽相同，许多厂家未经卫生部门的允许擅自生产，并且六神曲质量评价体系尚不完善，导致市售六神曲样品的质量差异较大，市场上伪劣产品较多。目前，六神曲的评价指标主要为性状、鉴别、检查、浸出物、指纹图谱等，但由于其药材来源复杂及工艺的特殊性，建议应该引入消化酶作为评价指标。根据文献报道，对六神曲中蛋白酶及淀粉酶研究较多，但根据本实验室前期研究发现，已确定优势菌种为扣囊和米根霉，其中米根霉可产生纤维素酶和脂肪酶，这2 个指标在发酵工艺中还没被监测过。因此，日后将重点研究纤维素酶和脂肪酶活性，同时建立测定方法，以确保实验方法稳定可靠，从而进一步控制和评价六神曲的质量，为其临床用药安全有效提供参考。