郑司浩,赵莎,曾燕,刘美娟,尚兴朴,王继永
中国中药有限公司,北京 100195
中医药文化是中华民族文化的重要组成部分。在中药产地变迁的过程中,受历史文化、环境变化及人为影响等,中药材的品种复杂多变。特别是近几年,受经济因素的影响,野生品驯化为常规栽培品越来越多,中药材现有主产区与传统道地产区均发生较大变化。中药材品种与产地变迁的复杂性为中药材道地性鉴别提出严峻的挑战。目前,中药材品种与产地鉴别技术多依赖于传统形态与经验鉴别、显微技术及色谱光谱技术等,随着现代分子生物学,特别是基因组学的发展,越来越多的技术与方法应用于中药材品种与产地鉴别。本文通过对中药材品种与产地鉴别的技术与方法进行综述,结合最新的基因组学与分子生物学技术,为中药材品种与产地鉴别提供可行的解决方案,为中药材全产业链可持续发展提供参考。
品种是指经过人工选择,在遗传上相对稳定纯合、形态特征和生物学特性相对一致、可作为生产资料在农业生产中得以应用的作物类型,可分为地方品种和改良品种[1]。中药材品种广义上指由野生资源常规驯化的人工栽培品种(即地方品种)及经过系统的新品种选育过程得到的新品种(即改良品种),以常规驯化的栽培品种为主(本研究所述的品种均为广义的中药材品种)。目前,已实现栽培的中药材种类超过300 种,总种植面积接近1 亿亩(1 亩≈666.67 m2),大部分栽培品的驯化是种植户从当地的野生资源移栽后不断进行培育与扩繁,最后形成可栽培成活、可规模化种植的药材品种。历经长期的人工栽培与驯化过程,栽培品与野生品在中药基原植物外观性状、药材性状及有效成分含量等方面均存在差异。因此,本文将野生品与栽培品的鉴别作为中药材品种鉴别的重点。
随着人们对中药材需求的不同(工业单一成分提取、中成药组方优化、单味药配方颗粒及临床需求等)及经济产量的高要求等,育种家利用不同的育种方法从中药材野生资源及常规的栽培品中选育新品种,最终得到优质的中药材新品种。据不完全统计,2003—2019 年,已选育包括北柴胡、丹参、薏苡、青蒿、荆芥、桔梗等药材优良品种280 余个[2-4],市场产业化推广较好的有人参新品种“福星2 号”“新开河1 号”“新开河2 号”和“康美1 号”,甘草新品种“国甘1 号”,太子参新品种“施太1号”“拓参1号”“拓参2号”“拓参3号”,薏苡新品种“蒲薏6 号”和“金薏1 号”,白木香新品种“热科1号”和“热科2号”等。中药材新品种的鉴别研究较少,技术方法多以形态鉴别为主,同时结合新品种本身的特性进行鉴别。
道地性是中药的特色。道地药材指经过中医临床长期应用优选出来的,产在特定地域,与其他地区所产同种中药材相比,品质和疗效更好、质量稳定、具有较高知名度的中药材。道地药材的概念源于古籍中的诸多记载,《神农本草经》对道地的记载以古国名、古地名为主,如巴豆、巴戟天、蜀椒、蜀漆、秦椒、秦皮、吴茱萸、阿胶等,体现了古代朴素的生境观;《本草经集注》第一次从本草学的角度论述道地与非道地药材对临床疗效的影响,将品质、药材与分布联系起来,体现了道地的“小环境观”;《本草纲目》对道地的论述更注重水、土、气象及其相互关系等整体的论述,体现了道地的整体观[5]。道地药材的论述多与其产地及产区环境等相关联。
王秋玲等[6]通过比较《本草经集注》等5 部代表性本草著作发现不同著作记载道地药材种类的数量差异较大,且部分药材在不同的著作中记载的道地产区不尽相同,说明不同时期对道地药材种类认知不同,产区变迁整体较为频繁,大多为跨区域、长距离变迁。究其原因,主要是古代随着疆域的变化,新的野生资源被发现且质量更优;或是随着野生变家种的发展,栽培产区逐渐被市场认可,从而代替原来的野生产区成为道地产区。近代至今,基于人为影响及经济因素的驱动,很多新的栽培产区逐渐发展成为被认可的道地产区。这一现象应引起高度关注,以免产生随意引种、盲目扩种的不良影响。
2018 年12 月18 日,中华人民共和国农业农村部会同国家药品监督管理局、国家中医药管理局编制《全国道地药材生产基地建设规划(2018—2025 年)》,在未来几年建设东北、华北、华东、华中、华南、西南、西北七大道地药材产区,共计2600 多万亩。建设规划的目的是坚持道地药材的初衷,加强道地药材资源保护和生产管理,规划引导道地药材生产基地建设,防止适宜产区种植不规范、非适宜区盲目扩种,造成药效下降、道地性丧失,对促进特色农业发展和农民持续增收、加快发展现代中药产业、实现乡村振兴具有重要意义。
中药材的品种现状与产地变迁给鉴定工作带来巨大挑战。区别于经济作物等其他农作物品种,中药材品种有其独特的特点与分类。严格来说,常见的中药材栽培品种(即地方品种)很多都没有达到品种的层次,不能称其为品种,与品系的概念比较接近。随着人们不断对野生中药资源进行驯化和引种栽培,使野生资源逐渐形成很多栽培品种及由于地理位置变化而形成不同的变异类型。同时,这些变异类型又与产地引种变迁息息相关,产生更加复杂的特性变化。因此,中药材的品种与产地鉴别密切相关。
中药材因品种及产地不同,质量及功效存在差异,对于临床应用等均具有重要的影响。因此,中药材品种与产地鉴别研究对于中药质量控制及产业健康发展尤为重要。随着中药材栽培品种和产地的逐渐增多,传统的鉴别方法对于新的品种或品系及产地的鉴别已较为困难,新的鉴别技术也在不断发展。根据中药材品种广义的概念,中药材品种与产地鉴别主要分为栽培品与野生品的鉴别、常规栽培品不同品系间鉴别、新品种鉴别及产地鉴别。从根源上分析,中药材品种与产地间的差异形成原因是在时间足够积累或地理隔离的前提下,中药资源形成了稳定的外观性状差异、药效成分差异及遗传差异等,因此中药材品种与产地鉴别研究一般针对不同资源的外观性状、成分含量及遗传差异进行分析与比较。当前,针对中药材品种与产地的鉴别技术多以性状鉴别为主,显微鉴别及光谱、色谱技术鉴别为辅。同时,随着分子生物学及药用植物基因组学的发展,分子生物学技术也越来越多地应用于中药材品种与产地鉴别。中药材品种与产地鉴别一般需要应用多种鉴别技术进行综合分析,达到准确鉴定的目的。本文主要针对中药材栽培品与野生品鉴别及产地鉴别技术进行综述,为中药材品种与产地鉴别提供参考。
性状鉴别是中药材最常用的鉴别技术,也是中药材品种与产地鉴别的主要技术手段,主要利用中药材及其基原植物的形态学差异进行鉴别。中药材的外观性状与真伪优劣指标(道地性)具有较强的关联性,有“辨状论质”之说[7]。
3.1.1 品种鉴别 中药材品种的性状不同主要是因不同的种植环境、地域或栽培方式等,使中药材出现不同的外观表型,随着时间的不断推移转变为新的品种(栽培类型),其内在的质量指标也随之发生变化。野生品与栽培品的差异较为明显,如银柴胡、黄芩、丹参、党参等,野生品与栽培品相比,其药材的形状、断面、质地等均有较明显的变化[8]。中药材新品种的鉴别也多采用性状鉴别方法。余昌俊等[9]通过比较天麻2个新品种与4个主要栽培品种的生物性状及品质性状等,发现天麻不同品种在花茎颜色、球茎形状等方面均具有显著差异,可作为天麻新品种鉴别及选种栽培的参考依据。
3.1.2 产地鉴别 中药材产地鉴别也多与性状差异相关。李旻等[10]采用分光测色计将中药材的性状品质中的色泽指标客观化、数量化,可实现对不同类别与产地陈皮的准确鉴别与分级。沈昱翔[11]采用色差计法结合可见分光光度法对19 个产地的丹参药材表面和断面颜色进行量化表达分析,可作为对中药材产地性状鉴别的新尝试。
随着数码图像及计算机技术的快速发展,应用图像识别技术对中药材的品种与产地进行快速鉴别是一个特色发展趋势,将形态学及性状鉴别的技术要点以图像的形式进行拍摄并进行特征信息提取,以大数据技术作为辅助分析,在中药材产业化中具有较好的应用前景[12]。
中药显微鉴别是指利用显微镜对药材(饮片)切片、粉末、表面、解离组织或磨片制片,以及含有饮片粉末的制剂观察,并根据组织、细胞或内含物等特征进行相应药材鉴别的一种方法,多用于因性状较难鉴别、破碎中药材或粉末及粉末制成的制剂等的鉴别[13]。显微鉴别技术也可应用于中药材品种与产地鉴别。
3.2.1 品种鉴别 唐勇琛等[14]应用显微鉴别技术对黔产野生和栽培钩藤药材的横切面及粉末的显微特征进行观察,在表皮细胞的性状、茎表皮角质层特征等方面均发现不同特性。刘靖等[15]通过对内蒙古武川县大青山地区蒙古黄芪野生品与栽培品的根横切面、粉末进行显微观察,发现野生与栽培品蒙古黄芪的木栓层、石细胞、木质部导管性状等存在一定差异。
3.2.2 产地鉴别 陈如等[16]对不同产地槐米粉末进行显微量化研究,发现不同产地槐米的花粉粒或非腺毛存在差异。束晓云等[17]对不同产地甘遂进行显微与性状鉴别研究,研究表明,不同产地甘遂在纤维性、淀粉粒、乳汁管等均存在差异性。陈瑞芳等[18]对不同产地乌药进行显微与性状鉴别,石细胞、油细胞、分隔纤维、梯纹导管等是鉴别不同产地乌药的重要显微特征。
随着显微技术的不断发展,如偏光显微镜鉴定、电子显微镜鉴定等,显微图像信息越来越丰富,基于计算机技术的图像检索技术逐渐应用于中药显微鉴别研究,有助于中药显微鉴别向人工智能化方向发展,对于中药材品种与产地鉴别将是一种创新的尝试。
光谱技术对于混合组分的整体特征分析效果较为显著,如红外光谱、紫外光谱、X 射线衍射光谱、原子光谱、核磁共振谱等。光谱技术在中药材品种与产地鉴别方面有较多应用,以红外光谱应用最为广泛。
3.3.1 品种鉴别 林晓莲等[19]利用紫外光谱对野生与栽培玉竹进行检测,结果表明以水、三氯甲烷为溶剂时,野生玉竹的最大吸收峰及吸收值比栽培玉竹大。王兴文等[20]利用原子吸收分光光度法及原子发射光谱法对昭通野生与栽培天麻进行微量元素等测定,发现不同产地天麻中微量元素的含量差异显著。
3.3.2 产地鉴别 孙素琴研究团队建立中药材红外光谱三级鉴定法[21],对不同产地的茯苓皮[22]、枳实[23]、草乌[24]、陈皮[25]、蔓荆子[26]等进行有效的鉴别分析。也有报道采用红外光谱对不同产地的两面针[27]、党参[28]、人参[29]、肉苁蓉[30]、连翘[31]、红曲[32]、通光藤[33]、枸杞[34]、老鹳草[35]等药材开展鉴别研究。紫外光谱对不同产地的丹参[36]、杜仲[37]也有较好的鉴别作用。研究人员应用核磁共振氢谱指纹法对不同产地的浙贝母、人参、西洋参、三七、大黄、黄连等药材提取物进行差异分析,发现不同产地药材提取物差异较明显,可作为中药鉴定与品质分析的参考依据[38-39]。
光谱鉴别技术具有操作简便、快速、样品量小甚至无损、成本低、反映样品整体化学信息等优势,在中药材品种与产地鉴别中具有较为广泛的应用。随着光谱技术的不断发展与更新,新的光谱技术不断涌现。同时,随着测定样本量的不断加大,光谱鉴别技术可借鉴性状鉴别的发展模式,与计算机技术及多种数据分析技术相结合,建立综合数据库及标准,在中药材鉴别领域继续发挥重要作用。
色谱鉴别技术是目前使用较为普遍的中药质量评价技术,在中药材品种与产地鉴别方面也有诸多应用,常见的有高效液相色谱、薄层色谱、气相色谱、超高效液相色谱、毛细管电泳及色谱光谱联用技术。
3.4.1 品种鉴别 盛萍等[40]运用高效液相色谱法对野生与栽培伊贝母进行测定,结果发现,伊贝母2 个基原新疆贝母与伊犁贝母的野生与栽培品均为2 支。潘瑞乐等[41]对天麻不同种内变异类型进行化学成分分析,高效液相色谱分析结果表明,天麻不同变异类型天麻素含量存在差异,且野生品高于栽培品。
3.4.2 产地鉴别 付琳等[42]运用高效液相色谱法对10 种晋产野生黄芩根中黄芩苷、黄芩素与汉黄芩素含量进行比较,发现不同产地黄芩主要有效成分含量具有明显差异。运用高效液相色谱法在不同产地金银花[43-44]、单面针[45]、黄芩与柴胡[46-47]等均可发现其成分含量的差异。韩永成等[48]通过超高效液相色谱建立14 个不同产地金银花药材的超高效液相色谱特征性指纹图谱,可将其分为两大类。时维静[49]采用高效薄层色谱法对山东、河北和河南3 个不同产地的金银花药材进行分析研究,发现不同产地峰的数量和面积有所不同。研究人员利用气相色谱法对不同产地金银花挥发油进行测定,发现其指纹特征存在一定差异[50-51]。毛细管电泳及其延伸技术,如高效毛细管电泳、毛细管区带电泳等,在金银花[52]、太子参[53]、大青叶[54]等中药材产地鉴别已有初步的研究与探索。
色谱鉴别技术虽多用于中药质量评价,但丰富的化学成分数据、强大的多分析联用技术等优势使其在中药材品种与产地鉴别中可发挥重要的作用。随着更多联用技术的发展与应用,色谱鉴别技术按照“从整体到部分,先定性后定量”的原则,可在中药材品种与产地鉴别工作中发挥突出作用。
仿生识别是模仿动物的某一功能,将被识别的事物转化为高维空间数据,并利用几何方法进行计算分析和最佳化点覆盖识别。“四气五味”是中药材药性理论的主要内容之一,其中的“五味”即指酸、苦、甘、辛、咸,在功效方面的表现为“辛散、酸收、甘缓、苦坚、咸软”。仿生识别技术,如电子鼻和电子舌等,可根据中药不同的“味”实现对不同品种与不同产地的鉴别。
3.5.1 品种鉴别 杨文玺等[55]利用电子鼻技术对野生与栽培当归进行鉴别研究,发现当归野生与栽培品气味差异显著,电子鼻检测对气味判别与传统经验鉴别结果一致,可作为当归快速鉴别技术。林辉等[56]运用电子鼻技术对野生与栽培的喜马拉雅紫茉莉进行气味分析,结果表明,喜马拉雅紫茉莉野生与栽培品气味差异明显,电子鼻技术可对其进行快速区分。
3.5.2 产地鉴别 伍世元等[57]利用电子鼻技术结合主成分分析和线性判别分析方法可实现不同产地薄荷的准确鉴定。吴飞等[58]利用电子舌技术结合主成分分析和判别因子分析对不同产地枳实进行检测,结果发现,电子舌技术能较好地区分不同产地的枳实样本。曾燕等[59]采用电子舌技术对不同来源黄芩进行味觉信息分析,结果表明味觉信息分析可对不同来源黄芩进行分类。电子鼻技术对不同产地的大白菊[60]、川芎[61]、附子(黑顺片)[62]、砂仁[63]、白术[64]等均具有较好的识别效果。
仿生识别技术在食品安全性评价、环境检测以及疾病诊断等方面已有广泛的应用,并可弥补中药传统性状鉴别技术的经验与主观性强等方面的不足。仿生识别技术在基础条件摸索方面应加强理论及应用研究,建立相关的标准及数据库,并结合模式识别数据分析技术。
中药材要实现准确的真伪鉴别,特别是对不同产地与品种的同一种药材的鉴别,需要借助多种鉴别技术组合应用,并辅以化学计量学等多种模式识别数据分析技术。常用的化学计量学方法有主成分分析、判别分析、聚类分析、偏最小二乘法、簇类独立软模式法、人工神经网络、支持向量机等[65-66]。化学计量学也多与红外光谱、荧光光谱、原子光谱、紫外光谱、高效液相色谱等鉴别技术相结合,利用统计学分析方法对检测数据进行分析,以达到鉴别中药材品种与产地的目的。
3.6.1 品种鉴别 吴雪梅[67]运用红外光谱、紫外光谱、超高效液相色谱技术并利用数据融合策略结合化学计量学分析方法对野生与栽培滇重楼进行溯源研究,为中药材产地鉴别提供一种创新的尝试。
3.6.2 产地鉴别 李运等[68]运用傅里叶变换红外光谱结合化学计量学对5 个区域12 个产地三七进行鉴别分析,结果表明,多种模式识别技术可实现三七产地鉴别。程翼宇等[69]将红外光谱技术与可视化表达技术相结合对3 种不同产地中药当归以虚拟指纹图谱对药材产地的分类鉴别研究,是对红外光谱鉴定技术的拓展应用。近红外光谱技术结合化学计量学还成功应用于大黄[70]、葛根[71]、南五味子[72]、茯苓[65]、西洋参[73]、灵芝[74]、白芷与丹参[75]、延胡索[76]等药材的产地鉴别研究。马帅[77]应用三维荧光光谱结合多维模式识别技术对葛根、白及及西洋参进行产地溯源研究,对于中药材产地鉴别具有较好的参考作用。常璇等[78]利用原子吸收光谱及原子荧光光谱结合聚类分析方法,对宁夏中宁县和平罗县的枸杞进行分析,该方法可准确快速区别2 个产地的枸杞。王元忠等[79]利用紫外光谱结合化学计量学方法对不同产地三七进行鉴别研究,结果可将10 个三七产地样品分为4 类,为三七产地鉴别提供参考。张水寒等[80]利用高效液相色谱指纹图谱结合系统聚类法对不同产地的关黄柏进行分析研究,发现不同产地关黄柏的质量存在差异。Zhu 等[81]运用气相色谱-红外光谱联用质谱对不同产地马齿苋建立指纹图谱,该方法可用于鉴别中国南方与北方的马齿苋品种。
常用鉴别技术结合多维模式识别数据分析技术可以更好地挖掘与处理光谱或色谱数据,通过加大样本量并结合多种数据分析方法,在不同品种与产地间差异较小的药材鉴别方面具有较大的优势,特别是随着计算机技术的不断发展,使更大的数据量处理成为可能,为中药材品种与产地鉴别提供新的思路。
随着分子生物学的不断发展,越来越多的生物学技术应用于中药材品种与产地鉴别。按照分子生物学的发展历程及在中药品种与产地鉴定中的应用可将分子生物学技术分为蛋白质类凝胶电泳技术、基于凝聚电泳的分子标记技术、DNA 序列分析技术、基因组分析技术等。
3.7.1 蛋白质类凝胶电泳技术 李峰[82]通过过氧化物酶同工酶(POD)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)与酯酶同工酶(EST)-PAGE对3种栽培品种金银花进行鉴别研究,结果发现,2 种电泳技术均可区分大毛花、小毛花及鸡爪花3 种金银花品种。石俊英等[83]利用POD、EST-PAGE 对不同产地桔梗进行分析,结果表明,该方法可有效鉴别不同产地桔梗。
3.7.2 基于电泳的分子标记技术 基于凝聚电泳的分子标记技术主要有随机扩增多态DNA 技术(RAPD)、限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单重复序列标记(SSR)、简单重复序列(ISSR)等技术。
RAPD 技术在野生与栽培天麻[84-85]、人参[86]、白芷[87]等药材研究方面较深入。马小军等[88]利用AFLP技术对人参农家类型进行指纹图谱研究,结果说明不同类型人参存在遗传差异。陈祖云等[89]运用SSR技术对贵州天麻野生与栽培品种进行鉴别分析,发现SSR 技术可有效区分纯合子及杂合子,并实现野生和栽培天麻的鉴定。
胡珊梅等[90]利用RAPD 技术对不同产地泽泻进行遗传分析,发现不同产地泽泻具有不同的遗传特征。RAPD 技术在不同产地黄芩[91-92]、当归[93]、玉竹[94]的鉴别中均具有较好的研究基础。Mizukami等[95]运用RFLP 技术对日本8 个产地的野生柴胡进行分析,发现不同地理品系的柴胡多态性存在显著差异。齐琳洁等[96]基于黄芩基因组开发SSR 分子标记方法并对不同产地黄芩进行遗传差异分析,聚类分析可将10 个黄芩产地分为两大类。张文青[97]利用ISSR 技术对不同种源的黄芩进行鉴别研究,结果表明,黄芩主产区样本基本各聚为一支,部分种源间差异较大。
3.7.3 DNA 序列分析技术 DNA 序列分析技术主要是利用DNA 片段进行测序与比对分析以进行中药材品种与产地鉴别。研究人员利用内转录间隔区(ITS)序列对天麻不同变异类型进行分析,发现15个变异位点可作为天麻变型间的特异性鉴别,ITS序列可鉴别不同居群的天麻[98-99]。刘霞等[100]利用叶绿体psbA-trnH序列对川麦冬和浙麦冬进行分子鉴别,在49 位点处发现稳定变异位点。曹晖等[101]利用叶绿体matK序列对蛇床子不同地理居群进行分析,结果发现,蛇床子居群间亲缘关系与地理分布呈良好的相关性。
3.7.4 基因组分析技术 基因组分析技术应用于中药材品种与产地鉴别是当前研究的热点与难点。王梦涵等[102]利用叶绿体基因组(超级条形码)对不同产地及品种的麦冬进行分析,可作为基因组在中药材产地与品种间鉴别应用的良好示范。药用植物全基因组因其本身的遗传复杂性以及起步较晚,目前已有全基因组序列的药用植物不到100 种。由于目标性状药用植物功能基因研究进展缓慢,给中药材品种与产地鉴别带来挑战。
随着分子生物学技术的不断发展,会有越来越多的生物学技术应用于中药材品种与产地鉴别研究。药用植物基因组学的发展,基于基因组学及功能基因研究的全基因组关联分析(GWAS)成为解决当前中药材品种与产地鉴别难题的关键技术。特别是随着中药材栽培品种及产地变迁的复杂变化,更需要以中药材遗传物质为分析单元的分子生物学技术提供更加准确、快速、科学的鉴别方法。
中药材品种与产地鉴别是目前中药产业与行业面临的巨大挑战,中药材品种与产地鉴别技术的研究与发展同样面临较大的困难与机遇,特别是随着近些年健康产业的兴起,中药材产业标准化与规范化是未来的主要发展趋势。
本文通过总结中药材品种与产地变迁的现状,对影响中药产业健康发展的品种与产地鉴别技术的发展进行综述。传统的中药材品种与产地鉴别技术(如性状鉴别技术、显微鉴别、光谱与色谱鉴别技术)在当前中药材品种与产地鉴别研究中仍然发挥重要作用。仿生识别技术、多维模式识别技术的组合应用为中药材品种与产地鉴别提供新的思路。分子生物学是当前较为热门的发展学科,分子标记及基因组学是当前发展较为热门的领域,在中药材品种与产地鉴别研究中已开展诸多的探索。基于中药产业的发展及鉴别技术的研究现状,对于未来中药材品种与产地鉴别技术的发展提出如下几点思考与建议:第一,传统的鉴别技术,如性状、显微及光谱技术等,仍然是中药材品种与产地鉴别的主要应用技术,应多结合模式识别数据分析方法及计算机技术,建立大样本量数据库,开发可产业化推广的应用技术;第二,仿生识别技术等特色技术是中药材品种与产地鉴别技术发展的新思路,应多加强基础理论研究,建立相关标准,为特定类型的中药材品种与产地鉴别提供技术支撑;第三,基因组学等分子生物学鉴定技术是实现中药材品种与产地鉴别的核心技术,应加强基因组学基础研究,基于挖掘与开发SSR 或SNP 等标记技术的基因组学研究新模式,探索并制定可实现中药材品种与产地鉴别分子生物学应用技术开发与产业化的快速、经济、专业、科学的研究方案,为中药产业健康发展保驾护航。