沉香属植物组培快繁研究进展△

张燕，孟慧，吕菲菲，魏建和，杨云*，李浩凌，陈波，黄良明

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室/濒危药材繁育国家工程实验室，北京 100193；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 海南分所 海南省南药资源保护与开发重点实验室/国家中医药管理局沉香可持续利用重点研究室，海南 海口 570311

沉香是来自沉香属（Aquilaria）植物受伤后所形成的含树脂的木材，共有21 个种[1]，主要分布在亚洲，西起印度北部，东到巴布亚新几内亚，北至中国北回归线附近，南达印度尼西亚岛屿。沉香属所有植物均可产沉香。白木香A.sinensis（Lour.）Gilg 为我国特有种，是我国国产药用沉香唯一的基原植物[2-3]，主要分布在海南、广东、广西、福建、云南和台湾等地[4]。自古以来，沉香就被公认为“香中之王”“药中黄金”，也是我国道地的“十大南药”品种之一，具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效[5]。目前，沉香已成为海南岛特色产业之一，在海南省2018 年印发的《海南省沉香产业发展规划》中将“香岛”建设列入其中[6]，2020 年沉香也被海南省列为继槟榔、椰子、橡胶后的“第四棵树”重点发展。

沉香树的繁育方式以种子繁育为主，而种子为顽拗型种子，极易丧失活力，难以保存[7]。生产中发现的优质植株通过种子繁育的后代无法保留其母本的遗传特性，不利于优良种质资源的保存与延续[8-10]。目前，沉香种质资源方面的研究较少，面临流通中种子、种苗来源混乱、质量参差不齐等问题[2-4]。因此，在获取优良沉香种质资源的同时，想要获得大量优质种苗，从种子繁育技术角度存在技术瓶颈[11]。

大量研究表明，植物体外组织培养能够有效地缩短繁殖周期，稳定地保存优良遗传特性，并为产业发展提供优质种质材料。沉香属所有种均为濒危物种，采用组织培养方式扩繁对保存种质优良特性、保护野生资源、维护生态平衡和促进产业发展有重要意义。利用优良种质组培苗推进优质沉香树种大规模种植，将人工栽培资源作为野生资源替代品，能够在减少野生资源过度破坏的同时对生态环境的改善及物种多样性的维护有极大的促进作用。采用组织培养方式培育的优良种苗能为中医药产业和大健康产业提供优质充足的沉香原料，有效促进我国沉香产业的发展。为了拓宽沉香树育种途径、改良其品质，前人对沉香属植物种质的快速繁殖进行了大量研究，并建立了沉香属植物的再生体系。目前建立的沉香属植物再生体系不够完善，并没有广泛应用于产业化生产中。本文综述了沉香属植物组织培养所采用的再生途径，并对其不同培养方式下外植体选择、植物生长调节剂的添加及组培过程中常见的问题进行总结，希望能为沉香属植物育种工作提供参考。

1 快速繁殖途径

木本植物组织培养主要有器官发生途径、体细胞胚发生途径和腋芽生枝途径3种[12]。在沉香属植物组织培养中，器官发生途径的应用分为直接器官发生和间接器官发生2 种，即通过外植体直接诱导不定芽和先诱导外植体脱分化为愈伤组织，再通过愈伤组织分化出不定芽，进而诱导生根形成再生植株。沉香属21 个种的植物均能产生沉香，但研究者多围绕着分布较广或研究者所在区域生长的沉香物种进行组培快繁研究。叶勤法等[13-14]通过直接器官发生和间接器官发生途径均成功建立了中国白木香A.sinensis植株再生体系。相关研究通过直接器官发生途径对沉香属植物中国白木香、印度沉香A.agallocha、马来沉香A.malaccensis、厚叶沉香A.crassna、密毛沉香A.hirta等进行组织培养研究并获得再生植株[8,15-20]。腋芽生枝途径在沉香属植物组织培养中的应用体现在将萌发并伸长到一定长度腋芽用作幼嫩无菌材料，进而通过直接器官发生途径诱导不定芽。林超[8]、张卫华等[17]利用带芽茎段为外植体诱导腋芽萌发，以新萌发的腋芽获得丛生芽，并建立了植株再生体系。体细胞胚发生途径仅停留在悬浮细胞的培养，未见有学者通过悬浮细胞再生植株。有研究者对白木香悬浮细胞体系的建立进行研究[21]，主要通过悬浮细胞培养研究沉香主要成分倍半萜类、色酮类化合物产生，但均未进一步通过悬浮体系进行植株再生研究[22-25]。目前，通过器官发生途径进行组织培养能够产生再生植株，建立再生体系，但是该繁殖方式并没有替代播种繁殖成为沉香种苗生产的主流方式。

2 组织培养影响因素

2.1 外植体选择

植物细胞具有全能性，每个细胞都具有该植物体的全部遗传特性，在一定条件下都能发育成完整植株。林木组织培养中，外植体的选择影响植株再生途径，并且在器官发生途径中一定程度上决定采用的发生方式（直接器官发生或者间接器官发生）。孙海菁等[26]在弗吉尼亚栎不定芽增殖及试管苗再生影响因子研究中选择2～4 年生植株上未木质化的枝条，切割成带芽茎段作为外植体。刘盼盼等[27]在枫香优良无性系组织培养研究中也选取枫香优良单株当年生的枝条做外植体，将枝条剪切为带有1～2 个腋芽的茎段。曹昆等[28]则倾向于叶片作为外植体，认为在一些濒危树种组织培养中，叶片由于其来源广泛、可再生能力强，并且采摘叶片对母树伤害小的优势可作为组织培养最佳的外植体材料。

沉香属植物作为木本植物，根据现有文献的报道，通常采用器官发生途径再生植株，所选用的外植体有茎段、叶片、胚、胚轴、子叶、根等。木本植物不同外植体在相同条件下产生的愈伤组织能力和植株再生能力也不一样[29]。沉香树组织培养中带腋芽的幼嫩茎段是最佳材料，能直接诱导腋芽和不定芽萌发，且茎段形成的愈伤组织能够成功获取不定芽，发育成苗[13,30]。茎段作为外植体有容易获取、操作简便、诱导率高的特点。有研究者采用茎段作为外植体材料诱导愈伤组织，通过愈伤组织分化培养成功获取不定芽[9,14,30-31]。相关研究通过白木香、印度沉香、马来沉香、厚叶沉香、密毛沉香等带芽茎段诱导出不定芽[8,15-20,32]。

2.2 外植体消毒

外植体进行无菌培养时，消毒是关键的步骤之一。正确适当的消毒，能够有效抑制细菌、真菌等微生物的繁殖，保证外植体在培养时不因染菌而受到侵害或死亡，提高成活率[30]。外植体消毒主要分为两步，首先用洗洁精溶液浸泡和清水流动冲洗0.5～1.0 h，除去表面污垢，其次在无菌环境中用适当浓度乙醇、次氯酸钠、升汞等溶液浸泡、晃动一定时间，以消除外植体表面微生物等。Saikia等[33]在马来沉香的愈伤组织培养中，将叶片用70%乙醇浸泡1 min 后5%～10%次氯酸钠溶液处理15 min。贾贤[30]用0.1%的升汞处理白木香叶片和茎段8 min，得到最高存活率。用0.2%升汞处理种子8 min，得到最高存活率。有研究者通过实验得出，0.1%的升汞处理10 min 为白木香叶片是最佳消毒方式[8-9]。汪腾越[9]得出，用0.1%升汞浸泡10 min 也是白木香顶芽和茎段最佳消毒方式。Daud 等[34]在研究适合马来沉香不同外植体（叶片、带节茎段和种子）的灭菌技术时，采用苯菌灵对外植体预处理，结合升汞处理后获得83%～90%的无菌且存活的材料。

升汞消毒和次氯酸钠消毒能有效清除白木香外植体表面的微生物。实际操作过程中使用消毒液处理外植体时应把握好消毒溶液浓度和处理时间，避免消毒时长不当造成外植体的利用率下降和资源浪费。外植体与消毒液接触时间过长会导致外植体褐变死亡，消毒时间过短则灭菌不彻底，外植体易受杂菌侵害，无法存活。

2.3 培养基的影响

培养基是植物组织培养的基础，培养基包含了植物生长所需的营养物质，包括碳源、氮源、无机盐、有机成分、植物生长调节物质以及水和琼脂[9,35]。其中氮源是影响植物体细胞胚发生的重要因素[12]。氮源主要以硝态氮（NO3--N）和氨 态氮（NH4＋-N）为主，两者的比例对植物细胞的生长有很大的影响。通常，NO3--N 高有利于细胞增殖和胚性愈伤组织的诱导[35]，硝酸铵（NH4NO3）的含量直接影响体细胞胚发生[12]。李湘阳等[36]通过地被银桦试管苗增殖培养研究得出，较高浓度的硝酸铵（NH4NO3）会抑制地被银桦试管苗生长。反之高含量的NH4＋-N则促进细胞组织的器官分化和体细胞胚胎建成[35]。无机盐中大量元素的配比在植物组织培养中对芽的诱导也十分重要。刘英等[37]在西南桦以芽繁芽组培快繁研究中得出，K∶Ca∶Mg=1.00∶0.04～0.08∶0.02～0.04，N∶P=1.00∶0.02～0.03时，西南桦侧芽萌发正常，能够迅速进入增殖状态。

沉香属植物组织培养研究中，多选用MS 培养基和1/2 MS 培养基为基础培养基，许多研究者在直接器官发生途径和间接器官发生途径中均通过MS培养基和1/2 MS 培养基成功诱导愈伤组织分化和茎段腋芽、丛生芽萌发。叶勤法等[14]在MS培养基中诱导出白木香愈伤组织，并用所产生的愈伤组织团块成功分化出芽。Saikia等[38]在马来沉香的愈伤组织诱导试验中发现，MS培养基更适合叶片和带节茎段的愈伤组织诱导。何旭君等[15]在白木香组织培养中以1/2 MS培养基为基础培养基诱导产生丛生芽并增殖。在沉香属植物生根诱导中，1/2 MS 培养基更适用于两步生根法。相关研究在沉香属植物组织培养中采用两步生根法，并在1/2 MS 培养基中成功获得不定根[8,14,17,32]。而有研究采用一步生根法分别在1/2 MS、1/3 MS、7/10 MS培养基中获得不定根[15,30,39]。

此外，Minh 等[18]在厚叶沉香的组织培养中得出，相比MS 培养基，WPM 培养基是更好的基础培养基的结论。Hassan等[19]在WPM 培养基中培养马来沉香，诱导出较高长度的芽。笔者通过WPM 培养基诱导出白木香不定根。因此，在后续的研究中，可尝试改良MS 培养基的部分组成成分，调整氮源中硝态氮和氨态氮的比例以及大量元素的配比，或尝试其他低盐度的培养基以达到更好的培养效果。

2.4 植物生长调节剂的影响

2.4.1 对愈伤组织形成和分化的影响 植物生长调节剂的添加配比决定了外植体的发育方向。沉香属植物通过间接器官发生途径培养再生植株过程中，愈伤组织诱导较容易，而愈伤组织分化形成不定芽较困难。诱导愈伤组织形成和分化所用的植物生长调节剂有细胞分裂素和生长素，且通常情况下细胞分裂素的添加量大于生长素。Jayaraman等[40]在研究植物生长调节剂对愈伤组织的影响中，加入2.2 μmol·L-1苄基氨基嘌呤（BAP）和1.1 μmol·L-1萘乙酸（NAA），能有效诱导马来沉香叶外植体产生松软的愈伤组织以建立细胞悬浮培养。汪腾越[9]通过白木香茎段产生愈伤组织的最佳培养基为MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA。并在MS+0.75 mg·L-16-BA+0.25 mg·L-1NAA 培养基中愈伤组织分化出不定芽。叶勤法等[14]在MS培养基中分别加入1.0 mg·L-1BAP和0.05 mg·L-1NAA愈伤组织不定芽分化最好。张翘等[7]以胚为组织培养外植体材料，在MS+0.5 mg·L-1玉米素（ZT）+0.1mg·L-1吲哚乙酸（IAA）培养基中丛芽诱导率最高。而兰芹英等[41]的实验结果表明，细胞分裂素小于或等于生长素时可以诱导愈伤组织分化，但分化率低，子叶愈伤组织在1/2 MS+0.5～2.0 mg·L-1BA+2 mg·L-12，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）中分化率仅为18.18%和22.73%。Saikia等[38]也表示在MS培养基中加入较低的细胞分裂素［0.1 mg·L-1激动素（KT）］和较高的生长素（2 mg·L-12，4-D）获得高产量和高质量的愈伤组织团块，但在MS 培养基中加入较高的细胞分裂素（1.0～2.0 mg·L-1BAP）和较低的生长素（0～0.5 mg·L-1NAA）能从新鲜的愈伤组织团中诱导出不定芽。

2.4.2 对芽萌发的影响 相对于诱导愈伤组织分化，直接诱导不定芽产生方式的萌芽率更高。直接诱导芽萌发有操作简约、诱导时间短、变异概率小等特点。笔者通过研究发现，茎段直接诱导腋芽萌发获得无菌材料后，有利于后续的不定芽产生和生根诱导。在促进芽萌发和增殖的培养基中细胞分裂素的添加量高于生长素的添加量，6-BA 使用量为0.05～2.00 mg·L-1，NAA使用量为0.01～0.20 mg·L-1。

林超[8]利用茎段成功诱导腋芽萌发的培养基为1/2 MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA。何旭君等[15]研究表明，白木香茎段直接诱导腋芽培养基为1/2 MS+0.2 mg·L-16-BA+0.01 mg·L-1NAA。徐强兴等[32]利用茎段直接诱导丛生芽，在1/2 MS+0.2 mg·L-16-BA 培养基中获得最高芽诱导率和丛芽数量。Hassan等[19]在添加0.1 mg·L-1BAP的MS培养基和WPM培养基中均获得较高数量的密毛沉香丛生芽，且芽的长度最大。Minh等[18]添加1 mg·L-1BA和10%椰子水（CW）于WPM培养基中，厚叶沉香茎尖外植体和茎段外植体均能在该配比的培养基中产生初代芽。Debnath 等[20]在MS培养基中补充4 mg·L-1BAP 和0.5 mg·L-1NAA，可以在印度沉香带节的茎段外植体上获得大量的丛生芽。

2.4.3 对芽增殖的影响 增殖是组织培养的重要过程之一，也是组培苗能否进入产业生产的关键部分[42]。许多学者在沉香属植物组织培养中都建立了增殖体系。林超[8]得出丛生芽增殖的培养基为MS+0.5 mg·L-16-BA+0.01 mg·L-1NAA，何旭君等[15]得出丛生芽增殖培养基为2/3 MS+0.2 mg·L-16-BA+2 mg·L-1水解乳蛋白（LH）。Minh 等[18]利用0.1 mg·L-1BA、0.1 mg·L-1NAA 和10%CW 获得最佳的增殖效果。Debnath 等[20]在添加0.2 mg·L-1BAP 的MS 培养基中进行继代培养，芽的数量增加了18 倍。徐强兴等[32]在1/2 MS+0.1 mg·L-16-BA 中获得最高增殖率，且增殖芽生长正常，玻璃化率最低。增殖培养中，除了考虑植物生长添加剂的类型和浓度，细胞分裂素和生长素的比值也应重视。细胞分裂素和生长素的比值较大时，有利于促进丛生芽的形成，但总体浓度不应过高[28]。增殖周期也是影响增殖效率的重要因素，周期过短，可能会导致增殖新芽数量少或质量差；周期过长，会对已形成的新芽造成不利影响，并且加大成本[42]。

2.4.4 对生根的影响 在沉香属植物组织培养中，生根是最关键的一步，且难度极大。许多研究认为，在扦插生根中添加植物调节剂，能够有效地调节植物内源激素和酶类活动，从而促进植物生根[43]。在对一些较难生根树种进行扦插生根培养时，添加植物生长调节剂能够有效地促进根系发育。

针对沉香属植物组织培养生根困难问题，除了常规的培养基生根方法外，研究者采用两步生根法（间接生根法）、瓶外生根法和浸泡生根法都使无根组培苗产生不定根。这3种方法相似之处在于先将无根芽或苗用植物生长调节剂处理一定时间后转移至不添加任何植物调节剂的培养基中。叶勤法等[13]将无根苗接种至1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA的培养基中培养2 d后转入1/2 MS培养基中培养，生根率最高达94.4%。林超[8]将白木香不定芽接种至含0.1 mg·L-1NAA 的1/2 MS 培养基中培养7 d，然后转入1/2 MS培养基中，生根率可达到75%。此外，兰芹英等[41]采用了瓶外生根，将无根组培苗用1000 mg·L-1的NAA 溶液处理20 min 后移栽到装有粗沙的容器中，生根率达到85%。何梦玲等[16]在印度沉香的组织培养中选择将生根材料基部在无菌的1.0 mg·L-1NAA 溶液中浸泡48 h后，接入1/2 MS 培养基中，生根率达到90% 以上。Debnath 等[20]将印度沉香生根材料在含有40 mg·L-1吲哚丁酸（IBA）的1/2 MS 液体培养基中培养48 h，然后在含有2 mg·L-1IBA 的1/2 MS 固体培养基中继续培养1 周，最后转移至不含植物生长添加剂但添加0.2%活性炭的培养基中可有效生根。

2.5 培养条件的影响

光照是植物光合作用的必需条件，同样在植物组织培养中，光照是影响植株再生是否成功的重要环境因素之一。光照在组织培养中影响外植体的生长发育和增殖效果[44]。在药用植物中，光照会影响黄酮类等次生物质代谢[45]，而黄酮类化合物是与植物褐变密切相关的酚类物质[46]。因此，适合的光照条件可激活植物体内的抗氧化防御系统，并合成抗氧化物质[47]，减少或避免植物组织培养中的褐变现象。在木本植物组织培养中，光照质量、数量以及光周期对植物生长发育有很大的影响。有研究表明，在木本植物组织培养中，LED 灯作为光源有助于植物生长并且提高代谢活性[48]。李湘阳等[49]在厚叶沉香组织培养中发现，组培苗对光质比较敏感，并通过研究证明LED 灯红蓝混合光（75%红光+25%蓝光或25%红光+75%蓝光）有利于组培苗的增殖，传统的荧光灯并不是其最佳光源。此外，Minh 等[18]表示高强度的光照更有利于芽的增殖。

温度对植物组培苗的增殖也是十分重要的，甘蔗作为热带、亚热带生长的碳四（C4）植物，在组织培养中，温度达到28～30 ℃时，增殖系数最高[50]。沉香属植物组织培养研究中，都明理等[51]得出，将普通的培养温度25 ℃提高至（31±2）℃时，白木香丛生芽大量增殖且生长速度加快。Toruan-Mathius等[52]在研究马来沉香种间体外微繁殖的相容性时，也将培养温度提高至（27±2）℃。

3 存在问题及对策

植物组培技术在生产和试验探索中逐渐趋于成熟，但仍然存在影响组培成功的问题，尤其在木本植物的组培中，褐变、玻璃化、生根是普遍且关键的难题。

3.1 褐变及对策

褐变是影响组培成功的一大难题，尤其在木本植物组培中问题尤为严重[53]。外植体褐变分为酶促褐变和非酶促褐变，在植物组织培养中普遍认为酶促褐变是导致组培物质褐变的主要原因[54]。一般认为，酶促褐变与多酚氧化酶（PPO）活性和总酚含量密切相关[53,55]。木本植物组织培养中影响褐变发生的主要因素有外植体类型、培养条件和培养基[56]。培养基根据无机盐的成分含量可分为高盐成分培养基、中等无机盐含量的培养基和低无机盐类培养基，如植物组织培养常用的MS 培养基属于高盐成分培养基。

沉香属植物组织培养可以通过培养基改善褐变现象，除了使用降低浓度后的1/2 MS 培养基以外，采用低无机盐类木本植物培养基WPM 来缓解褐化现象，B5 培养基也较适宜木本植物的组织培养[53]。还可以通过添加抗氧化剂抑制酚类氧化褐变，如添加VC、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、硫代硫酸钠（Na2S2O3）、柠檬酸（CA）、二硫苏糖醇（DTT）、植酸（PA）、半胱氨酸（CYS）、硝酸银（AgNO3）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）等能有效防止酚类氧化褐变；添加吸附剂吸附酚类化合物，如活性炭（AC）、PVP 等对减轻褐变现象有显著作用[57-60]。除了添加一般的抗氧化剂和吸附剂之外，添加苯丙氨酸化合物抑制剂2-氨基脒-2-膦酸（2-aminoindane-2-phosphonic acid，AIP）也能有效减少组培过程中的褐变[61]，持续热击处理产生的hPSp 蛋白可以阻止苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性增加，从而控制褐化[54]。有研究表明，纳米碳作为培养基添加物可以提高植物抗氧化能力，添加纳米碳不仅可以抑制大花蕙兰在组织培养过程中产生的褐变现象，还有利于原球茎生长，且不影响其继代增殖[62]。除此之外，选择较嫩的外植体，适当的暗培养也能一定程度上减轻褐变。褐变是多种因素综合作用导致的，在控制和减少褐变时也应综合利用多种措施[57]。

3.2 玻璃化及对策

玻璃化也是组织培养中常遇到的不良状况。玻璃化是在培养过程中出现半透明鲜绿水渍状，伴随着叶片卷曲或肿胀，且脆弱易碎等现象[57]。培养基成分和培养环境可能导致玻璃化，培养环境湿度是造成玻璃化的重要因素之一，湿度过高会导致组培苗玻璃化，可以选择透气性好的材料用于组培瓶封口，降低湿度[28,63]。自然光照对玻璃化有一定的抑制作用，采用光自养微繁殖技术，使用大型培养容器，提高空气流通性，能使玻璃化现象得到改善，促进组培苗生长[63-64]。研究发现，降低NH4+能减少瑞香玻璃化苗，40 ℃电击处理愈伤组织可以消除瑞香再生植株的玻璃化现象[65]。降低无机盐和植物生长调节剂的浓度、采取偏酸性的培养条件、弱光培养（暗培养）、加大昼夜温差等都能有效缓解玻璃化问题[32,57]。

3.3 生根难及对策

生根效率低、所需时间长等现状严重阻碍了沉香属组织培养产业化进程。培养基中的大量元素、微量元素、植物生长调节剂浓度和固化剂的种类是生根的决定因素[66]。低浓度的大量元素和微量元素培养基更有利于沉香属植物生根；沉香属植物间接生根的效果优于直接生根[14]，根据该特征可通过改善生根方法提高生根率，适当利用间接生根、瓶外生根和浸泡生根法培养沉香属无根芽苗，或可将间歇浸没式植物生物反应器应用于沉香属植物组织培养。

4 展望

沉香作为濒危药材和名贵香料在中国使用历史悠久，《本草纲目》记载：“海南沉香，一片万钱，冠绝天下”，现今沉香仍在160多味中成药中应用[67]。中国古代四大香“沉檀龙麝”，沉香位列百香之首[68]，沉香也是国际高端香水的重要成分。人们对沉香资源的过度开发导致野生资源濒危，为了保障沉香资源能够可持续利用，我国及东南亚各国近年来大面积推广沉香树种植，主要用种子繁殖[2,69]。通体结香技术的创新发明及少量传统结香技术的应用能够解决部分药用和后端沉香产业开发原料的供应[70]，但仍不能满足人们对高品质沉香的需求。

实践中发现，有少数种质具有优良的结香品质，但无法通过种子繁育方式保留其生物性状。采用无性繁殖的方式能保持繁殖母本遗传基因型，获得优良稳定的材料[71]。组织培养技术在沉香属植物繁殖上的应用经过多年探索获得了一定的成果，但是生根困难、褐变死亡、增殖效果不佳等仍然是组织培养再生植株的主要障碍。解决沉香属组织培养中的阻碍问题，建立成熟稳定的组培快繁技术体系对沉香产业的发展有极大的科学意义，能够在为沉香产业提供优质的结香树种的同时，对沉香属植物的保护和沉香资源可持续利用做出贡献。组培快繁技术在沉香繁育方面的完善和应用，能够实现沉香的药用价值和经济价值最大化，带动沉香产业成为我国沉香主产区经济发展新动力，并保持我国沉香产业在国际领先地位。因此，沉香属的组培快繁技术需要进一步深入研究，并大规模应用。