微小核糖核酸与骨不连

黄丽丽，章海军，何 悦，黄嘉琛，刘 源，胡 军

(1.南京医科大学第一附属医院感染病科,南京 210029；2.南京医科大学第一附属医院骨科,南京 210029)

骨不连是长骨骨折后较为常见的一种并发症，通常被定义为骨折超过9个月仍未愈合，并已连续3个月没有任何愈合迹象[1],尽管大多数骨折都能够实现正常愈合，但仍5%～10%会发生骨不连[2]。由于骨不连发生率较高，且治疗难度大，一直是国内外临床医师面临的难点和挑战。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类内生性非编码小分子RNA，可在转录后水平上调控基因表达，在细胞增殖、分化、凋亡等过程中发挥着重要作用[3]。近来研究发现，多种miRNA可以调节特定靶基因的表达而对骨不连发生发展过程中炎症反应、血管生成、成骨细胞分化及迁移等过程产生影响。但目前为止，未有对miRNA和骨不连之间的具体作用机制进行详细分析总结，因此，本文就两者之间的相关性作一综述，这为研究骨不连的发生发展提供了理论依据，为骨不连的诊断和治疗提供新的方向。

1 miRNA的生物学特征

miRNA是一类内生性非编码小分子RNA，长18～22个核苷酸，并且在整个进化过程中高度保守，可以调控基因的表达[4]，是众多生物过程的调控因子，包括发育、增殖、凋亡和细胞代谢等[5]。异常的miRNA表达会改变细胞内的翻译环境，导致有害的表型结果或疾病状态[6]。目前研究已经表明miRNA的异常表达与多种骨科疾病之间关系密切。Wang等[7]发现miR-21-5p在骨关节炎患者软骨组织中表达上调，且在骨关节炎小鼠模型中进行关节内注射miR-21-5p拮抗剂后可以显著减轻关节软骨退化，从而改善骨关节炎。在骨骼生物学领域，miRNA有助于调节成骨细胞和破骨细胞的分化和功能，在骨折中发挥重要作用[8]。最近一项研究表明成骨细胞中的miR-29a可以通过抑制破骨细胞调节因子核因子κB受体活化因子配体和CXC型趋化因子配体12来减少破骨细胞分化，从而减少骨质疏松对人体的伤害[9]。骨不连的发生发展过程中，伴随着多种信号通路的激活，如核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号通路、Wnt/β-catenin信号通路，这些信号通路中的转录因子如NF-κB、淋巴增强因子1等可以通过促进相关miRNA的转录从而使相关miRNA表达增加，进而调节骨不连中的炎症反应和骨骼生长等过程[10-11]。近年来，多项研究发现miRNA可以调节特定靶基因的表达而对骨不连发生发展过程中炎症反应、血管生成、成骨细胞分化及迁移等过程产生影响，下面就其在骨不连中具体作用机制作详细描述。

2 miRNA在骨不连中的作用

2.1miRNA在骨不连炎症反应中的作用 在骨折愈合早期，骨折部位出现炎症细胞浸润及炎症因子释放，释放的炎症因子可以促进间充质干细胞的募集、刺激成骨细胞及破骨细胞等。miRNA可以通过作用于骨折愈合过程中的炎症反应来影响骨不连的发生发展。一项研究在患有糖尿病的大鼠闭合性横向骨折模型中发现miR-181a-1-3p可以直接通过靶向降低IL-1α的表达，导致骨折愈合过程中正常炎症反应的失调，从而导致骨折愈合受损，甚至愈合延迟和骨不连[12]。Gerstenfeld等[13]发现在TNF-α受体基因敲除的胫骨骨干闭合性骨折小鼠中骨折愈合会严重受损，并产生膜内和软骨内骨化延迟。而Waki等[14]通过一系列通过灼烧骨折部位骨膜构建的大鼠骨不连模型的研究中发现miR-140-3p的表达比正常骨折愈合组的有明显改变，miR-140-3p可以通过靶向作用于NF-κB的共激活剂核受体辅激活蛋白1和核受体相互作用蛋白1，从而负性调节NF-κB的表达。而激活的NF-κB可作为TNF-α信号通路的重要反应分子，说明miR-140-3p对骨不连的炎症反应中的炎症因子起到负性调节作用[15]。另一项通过股骨截骨所致的骨不连小鼠中也发现miR-140-3p的升高，且也是作用于NF-κB来抑制炎症反应从而导致骨折愈合受损[16]。此外，Waki等[14]研究还发现miR-181a-5p和miR-451a在骨不连组表达增高，而这三种miRNA均已被证实参与调节炎症反应[17-19]，miR-181a-5p可以通过直接靶向降低IL-1α水平调节炎症反应，miR-451a则通过作用于14-3-3ζ和RAS癌基因家族成员Rab5a来抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的表达。在炎症信号通路中，炎症因子TNF-α和IL-1α可以激活MAPK的表达，MAPK通路的激活也会促进这些炎症因子的生成，这些结果都提示miR-451a和miR-181a-5p在骨不连的炎症因子的产生起调节作用[15]。也有研究发现骨不连大鼠的miR-31a-5p,miR-146a-5p,miR-146b-5p和miR-223-3p的表达与正常愈合大鼠之间存在差异[20]。这些miRNA都参与调节机体的炎症反应，抑制miR-31a-5p的表达可通过Wnt/β-catenin信号通路来降低热应激下人真皮成纤维细胞的炎症反应并提高其细胞存活率[21]，miR-146a-5p可以抑制促炎因子IL-1β、IL-6的表达[22]，而阻断miR-146b-5p会增加动脉粥样硬化相关泡沫细胞形成中的炎症反应[23]，miR-223-3p可以靶向作用信号转导和转录激活因子3来负性调节IL-1和IL-6的表达[24]。

2.2miRNA在骨不连骨骼生长中的作用 成骨、软骨形成和血管生成是骨折愈合修复阶段的主要过程。成骨细胞和软骨细胞增殖及分化功能受损，或血管形成异常均会导致骨折愈合障碍甚至不愈合[25]。骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是转化因子超家族的成员，可以通过刺激细胞增殖、分化和趋化、细胞黏附以及血管形成来刺激新生骨形成，增加新生骨痂的力学强度，从而促进骨折愈合[26]。相关研究表明miR-140-5p可以抑制未分化的人间充质干细胞的成骨作用，且可调节人脂肪干细胞的成脂和成骨平衡[27]，而BMP-2已被证实是miR-140-5p作用靶点[28]。Takahara等[12]在大鼠股骨闭合性横断骨折模型研究中发现miR-140-5p可以通过作用于靶基因天冬酰氨肽酶来抑制BMP信号通路，从而使骨折愈合中的成骨，软骨形成和软骨内骨化过程受损，导致骨不连。Waki等[14]在灼烧骨折部位骨膜形成骨不连的大鼠中也发现miR-140-5p表达明显下降。miRNA除了作用于BMP-2，最近一项研究发现抑制miR-342-5p可以通过上调BMP-7的表达，激活丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号传导通路，从而促进成骨细胞的增殖、分化和迁移[29]，在骨不连发病机制中起重要作用。

Wnt/β-catenin信号通路在成骨分化中促进细胞增殖和矿化、阻止细胞凋亡，还可促进间充质祖细胞向成骨细胞的分化，在骨折愈合中发挥着重要作用[30]。Pannexin间隙连接蛋白3(pannexin gap junction protein family member 3，PANX3)是由软骨细胞和成骨细胞的增殖和分化诱导而来[31]，Jia和Zhou[32]开展一项研究发现下调miR-367的表达则会通过激活PANX3介导的Wnt/β-catenin途径促进成骨细胞在骨折过程中的生长和增殖，说明miRNA可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来影响骨折愈合甚至骨不连。此外，有研究表明miR-381在萎缩性骨不连形成过程中通过与Wnt5a和卷曲同源物3的3’端非编码区结合，调节β-catenin的核转位，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路，调节人骨髓间充质干细胞的成骨作用[33]。同样，miRNA也可以通过激活Wnt/β-catenin信号通路来调节骨不连的骨骼生长。Sun等[34]研究表明将miR-26a模拟物注射入骨不连大鼠中后引起miR-26a过表达，可以观察到骨钙素和碱性磷酸酶表达增加，表明促进了骨折的愈合，进一步研究发现硬化蛋白结构域蛋白1(sclerostin domain-containing1，SOSTDC1)可以负性调节Wnt/β-catenin信号通路，且SOSTDC1已被证实可以抑制骨折愈合。他们进一步推测miR-26a可能通过靶向抑制SOSTDC1的表达从而进一步激活Wnt/β-catenin信号通路，增强间充质干细胞的成骨分化，进而实现其对促进骨不连大鼠骨折愈合的作用。

2.3miRNA在骨不连血管生成中的作用 充分且稳定的血液供应对于骨折愈合至关重要，如果骨折愈合过程中血管生成不佳，导致骨折愈合延迟甚至骨不连。miR-210-3p在低氧后的反应性血管生成中发挥着关键作用，其过表达后可以增强毛细血管样结构的形成和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)驱动的内皮细胞迁移。miR-210-3p在低氧状态下的相关靶向作用点是促红细胞生成素肝细胞受体配体A3(erythropoietin-producing hepatocellular receptor ligand-A3，Ephrin-A3)，Ephrin-A3可以通过VEGF途径控制的Eph-Ephrin系统，调节血管生成[35]，有研究证明通过关节内注射双链miR-210-3p可以增加血管生成从而促进大鼠前交叉韧带部分撕裂的愈合[36]。Takahara等[12]对大鼠闭合性股骨干横行骨折研究后表明miR-210-3p在骨折愈合后期表达下降可能会抑制骨折愈合过程中正常血管生成，从而导致骨折愈合不良甚至骨不连。同时，他们还发现miR-222-3p在骨折愈合早期表达增高时可以抑制血管生成，影响骨折愈合。miR-222-3p可以通过直接抑制干细胞生长因子受体的表达来减少细胞存活、迁移，从而抑制血管形成，使骨折愈合延迟甚至发生骨不连。

3 miRNA作为骨不连诊断和治疗的新靶点

目前骨不连的诊断主要依靠影像学检查，其中X线片和CT是临床上运用最广泛的诊断方法，但亦存在一定的局限性，如营养不良性骨不连较难在早期通过影像学检查明确诊断。同时，感染性骨不连由于微生物培养阳性率低，且非特性炎性指标诊断效能低，急需一种更具优势的诊断指标来诊断[37]。临床上检测miRNA的方法主要有实时荧光定量PCR技术(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)、荧光原位杂交技术、miRNA芯片技术等。Romeo等[38]使用qRT-PCR检测血浆中miR-375的表达，发现miR-375升高是晚期甲状腺髓样癌患者预后不良的可靠检测指标。而Renwick等[39]研究使用荧光原位杂交技术对肿瘤活检组织中miRNA进行检测，用于鉴别皮肤基底细胞癌和梅克尔细胞癌。此外，Duan等[40]利用miRNA芯片技术筛选出在阿霉素耐药的骨肉瘤中表达明显改变的miRNA，进一步研究发现上调miR-15b的表达可以改善骨肉瘤化疗耐药。关于miRNA成本，Charytonowicz等[41]的研究通过对睾丸恶性生殖细胞肿瘤术后或化疗后疾病监测的成本分析发现，miRNA检测对比于CT检查作为复查指标可使10年内的复查成本减少约8 560美元，相对节省约44%预期成本。说明miRNA检测具有临床经济实用性，提示使用miRNA作为疾病监测的生物标志物前景广阔。miRNA作为调节体内基因表达的重要分子，与骨不连中的炎症反应、骨形成与软骨形成、血管生成等均证实存在联系。Scimeca和Verron[42]关于miRNA如何运用于骨折愈合领域提出了3条建议：(1)确定靶标miRNA并决定是否增加或降低其表达；(2)设计如何替代miRNA或抑制其表达；(3)使用特定运输方法来递送miRNA，并考虑其类型、转染效率和特异性。这些都为今后如何将miRNA应用于骨不连诊断和治疗提供新的思路。

目前临床上对于骨不连的治疗仍以手术治疗为主，如髓内钉内固定术、自体骨移植术等，此外一些促进骨折愈合的生长因子如骨形成蛋白、硬化分子等也被用于骨不连的治疗，基于miRNA的骨不连治疗目前仍处于实验室研究阶段，Zhang等[43]研究使用一种几乎无细胞毒性的超支化聚合物用于结合miRNA，并用可生物降解的微球对两者进行包裹，微球连接到无细胞的纳米纤维聚合物支架上，该支架可在空间上控制miR-26a的释放。这项技术通过控制miR-26a靶向作用于糖原合成酶激酶-3β进而激活内源性干细胞的成骨细胞活性，用于治疗小鼠颅骨临界性骨缺损，但miRNA用于临床治疗骨不连的相关报道仍然较少，需要进一步研究。

4 总结和展望

作为骨折常见的一种并发症，骨不连会造成患者长期行动不便和慢性疼痛，甚至导致再次手术、生活质量严重下降、无法正常工作。本篇综述初步介绍miRNA与骨不连之间的联系，阐述这些miRNA在骨不连中分子作用机制，可为骨不连临床诊断的生化标志物、基因治疗的靶向药物设计等方面研究提供新的思路。目前骨不连的诊断和治疗仍存在一定的难点和挑战，然而随着基于miRNA的骨骼生物学研究的不断深入，有望在加速骨折愈合，提高难治性骨不连救治成功率及改善骨折患者预后等方面逐渐取得一定的突破。