抗CD200 抗体对脓毒症小鼠肝脏保护作用及其机制的研究

曹利军，苏红专，孙璐，王宜娜，李洪英，刘登辉

脓毒症仍然是重症监护病房中的主要挑战，它以全身性炎症反应和多器官功能衰竭为特征[1]。肝脏被认为是脓毒症影响的第二大器官，在脓毒症的患者中，往往会出现肝功能的异常；但是，脓毒症引起的肝损伤一直被重症监护室的医师所忽视[2-3]。CD-200（cluster of differentiation 200）亦称OX-2，是新型免疫球蛋白超家族1 型跨膜糖蛋白，能够与CD200R1-4 结合。有研究证实，CD200/CD200R 信号通路在T 细胞反应的形成及维持中发挥着重要的负性调控作用，且参与T 细胞的分化和存活调控[4-5]。肝脏在多种疾病的免疫耐受中起了重要的作用，但使用CD200 阻断剂后，对于脓毒症相关性的肝损伤是否有保护作用及其可能的作用机制还不清楚。本研究旨在通过构建脓毒症肝损伤的模型，观察CD200 在小鼠肝脏组织的表达情况；探索抗CD200抗体对脓毒症小鼠肝损伤是否存在保护作用，并初步阐明其可能的作用机制。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 动物选取 C57BL/6 雄性小鼠（动物许可证号：SYXK（沪）2017-0004），年龄8 ～10 周，体质量22 ～30 g，购自海军军医大学实验动物中心。

1.1.2 主要仪器 L500 台式低速自动平衡离心机（湖南湘仪实验室仪器有限公司），OLYMPUSAU640全自动生化分析仪（日本OLYMPUS），电泳槽、转膜槽（Biorad 公司）。

1.1.3 主要试剂 anti-CD200 抗体（ab254193，Abcam 公司）；Isotype 抗体（重组抗小鼠IgG 抗体，ab190475）；ELISA试剂盒（ebioscience公司），RT-PCR试剂（TakaRa公司），p65 抗体（8242，CST公司）、phospho-p65 抗体（3031，CST 公司）、IB抗体（9242，CST公司）、phospho-IB抗体（9246，CST 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 脓毒症肝损伤模型构建 采用七氟烷麻醉小鼠，选取腹部正中切口，腹部皮肤常规消毒，切开腹部中线1 ～2 cm，暴露盲肠，用丝线在回盲瓣下结扎，用22 号针头穿刺盲肠两次，以诱发腹膜炎，将穿孔的盲肠回纳腹腔，缝合切口，再次消毒皮肤，用无菌纱布包扎腹部。假手术组（Sham）进行相同的程序，但不结扎和穿刺盲肠。手术后，给予小鼠1 ml 0.9%氯化钠注射液进行液体复苏。所有的小鼠在手术前后都不限制食物和水。

1.2.2 动物分组及处理方法（1）将16 只C57BL/6雄性小鼠分为Sham 组、脓毒症组（CLP 组），每组8只；手术后24 h 处死小鼠，取肝脏组织，加入2 ml 的PBS 缓冲液研磨，制作匀浆液，利用引物设计软件Primer5 设计CD200 引物：上游：5’-TACCAGACTGCCCATCCTTG-3’，下 游：5’-TTGGTCGTCTCTTCCTCCAC-3’，上海捷瑞生物工程有限公司合成引物，采用RT-PCR法检测各组小鼠肝脏组织CD200 mRNA 的表达水平。（2）将32 只C57BL/6 雄性小鼠分为Sham 组，脓毒症组（CLP 组）、CLP +同型对照抗体治疗组（Isotype组）、CLP+抗CD200 抗体治疗组（anti-CD200 组），每组8 只。各组均在手术后24 h处死小鼠。anti-CD200 组小鼠在手术后1h，通过腹腔注射anti-CD200 抗体30g/只，容积为100l；Isotype组在手术后1h通过腹腔注射同型对照抗体（重组抗小鼠IgG 抗体）30g/只，容积为100l。

1.2.3 检测外周血天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT） 心脏穿刺取血，全自动生化仪检测外周血AST、ALT 水平。

1.2.4 肝脏组织病理 取肝脏组织，使用HE 染色，镜检观察各组小鼠肝脏组织的坏死程度，病理读片评分标准：0 分：无坏死；1 分：个别细胞坏死；2 分：小于30%的坏死；3 分：30 ～60%坏死；4 分：大于60%的坏死[6]。

1.2.5 腹腔冲洗液细菌计数 充分暴露各组小鼠腹腔，用2 ml PBS 液反复冲洗腹腔，吸取全部腹腔冲洗液，倍比稀释至适宜浓度，涂抹于琼脂糖凝胶平板上，37℃恒温箱培养24 h 后，再进行菌落计数。

1.2.6 检测外周血及肝脏组织中细胞因子的表达水平 心脏穿刺取血，ELISA 法检测各组小鼠外周血中肿瘤坏死因子-（TNF-）、白介素-6（IL-6）水平变化；取肝脏组织，制作匀浆液，利用引物设计软件Primer5设计各细胞因子的引物，TNF-：上游：5’-GGGCTACAGGCTTGTCACTCG-3’，下游：5’-ACTCCAGGCGGTGCCTATGTC-3’；IL-6：上游：5’-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3’，下 游：5’-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3’，上海捷瑞生物工程有限公司合成引物，采用RT-PCR 法检测各组小鼠肝脏组织TNF-、IL-6 mRNA 的表达水平。

1.2.7 Western-blot法检测各组小鼠肝脏组织NF-B磷酸化水平 取肝脏组织，匀浆，离心后，以牛血清白蛋白为标准液，通过BCA 蛋白测定试剂盒（美国Thermo，USA）测定蛋白质水平。在非特异性结合位点封闭后，将膜与各种IB、phospho-IB、p65、phospho-p65 抗体在室温下放置2 h。IB是组成核转录因子-B（NF-B）的一个蛋白基团，当检测NF-B表达时，检测IB是一个很有效的手段。通过ECL检测系统证明蛋白条带。通过光密度分析评估信号并进行标准化。

1.3 统计方法 采用Gradphad Prism 5.0 以及SPSS 18.0 软件分析所有数据。计量资料采用均数±标准差表示，多组比较采用方差分析，多组间两两比较采用LSD- 检验；两组比较用 检验。＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD200 在脓毒症小鼠肝脏组织的表达情况Sham 组肝脏组织CD200 的表达为3.64±0.82，CLP组为7.19±1.17，CLP 组肝脏组织CD200 表达高于Sham 组（=7.053＜0.05）。

2.2 抗CD200 抗体对脓毒症小鼠外周血AST、ALT的影响 anti-CD200 组AST、ALT 水平均明显低于CLP 组（均＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠外周血ALT、AST 水平比较（ =8） U/L

2.3 抗CD200 抗体对脓毒症小鼠肝脏病理的影响CLP 组肝脏组织表现为较严重的肝损伤图像，可见大面积细胞变性，结构紊乱，细胞肿胀。anti-CD200组也存在肝损伤表现，但较CLP 组明显减轻，未见大面积的肝细胞坏死。病理评分显示，anti-CD200组 病 理 评 分（[1.82±0.45）分] 低 于 CLP 组（[3.23±0.84）分]，差异有统计学意义（=18.91，＜0.05）。见封二彩图1。

图1 抗CD200 抗体对脓毒症小鼠肝脏病理的影响

2.4 抗CD200 抗体对脓毒症小鼠腹腔冲洗液细菌负荷的影响 anti-CD200 组腹腔中细菌菌落数明显低于CLP 组（均＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠腹腔冲洗液细菌负荷的比较（ =8）

2.5 抗CD200 抗体对脓毒症小鼠外周血及肝脏组织细胞因子的影响 anti-CD200 组小鼠外周血及肝脏组织的TNF-、IL-6 水平均明显低于CLP组（均＜0.05）。见表3 ～4。

表3 各组小鼠外周血TNF- 、IL-6 水平比较（ =8）pg/ml

表4 各组小鼠肝脏组织TNF- 、IL-6 mRNA 表达水平比较 pg/ml

3 讨论

脓毒症是感染引起的全身炎症反应，也是多器官功能障碍综合征的重要原因[7]。CD200 可表达于各种免疫细胞，CD200 及其受体相互作用参与机体的免疫调节[8]。本研究发现，与Sham 组相比，CLP组小鼠肝脏组织CD200 的表达明显上调，这暗示CD200 及其受体可能参与了脓毒症小鼠肝损伤的病程发展免疫调节过程。

在第二部分实验中，笔者使用了CD200 阻断剂，来验证前面的推论。在临床工作中，一般是采用监测ALT、AST 水平来评估肝脏的损伤程度。本实验结果表明应用抗CD200 抗体后，其外周血ALT、AST水平明显降低。本文病理结果显示anti-CD200 组小鼠肝损伤的程度较CLP 组轻。另外，笔者比较了各组小鼠腹腔灌洗液细菌菌落的计数，结果显示应用抗CD200 抗体后，CLP 组的腹腔灌洗液的细菌菌落数有明显降低。这些结果不仅进一步说明CD200 及其受体的通路参与了脓毒症引起的肝损伤的疾病进展过程，还暗示抗CD200 抗体能够对脓毒症引起的肝损伤起到保护作用。

发生脓毒症时，机体产生大量的炎性因子，这些炎性因子与脓毒症引起器官和组织的损伤密切相关[9]。脓毒症引起的全身炎症反应可促使TNF-、IL-6 大量释放，研究证实TNF-是炎性反应过程中最早、最关键的炎性细胞因子，它在脓毒症引起的肝损伤中起重要作用[10]。已有研究报道血中IL-6 水平的高低与脓毒症的预后有密切关系[11]。本研究结果表明：CLP 组小鼠在接受抗CD200 抗体干预后，TNF-、IL-6 水平明显降低，抗CD200 抗体保护了脓毒症小鼠免受由于脓毒症引起的大量的细胞因子释放而导致的脏器损伤及继发的免疫抑制状态。

综上所述，脓毒血症小鼠肝脏的CD200 的表达水平明显升高；抗CD200 抗体对脓毒血症小鼠的肝损伤有保护作用，其保护作用可能通过抑制NF-B信号通路的活化，从而减少炎性细胞因子的释放。当然，本研究存在一定的局限性，如研究观察的时间点单一，未对脓毒血症肝损伤进行24 h 动态观察；只观察了NF-B 一个信号通路且未对信号通路的下游机制进行探讨。另外，本实验只选了一个抗CD200 抗体剂量进行研究，在下一步的工作中，还需探讨不同剂量的抗CD200 抗体在脓毒血症模型中的作用。

图1 抗CD200 抗体对脓毒血症小鼠肝脏组织NF- B 磷酸化水平的影响