肿瘤细胞TRAIL 耐药性的产生及缓解策略的研究进展

徐扬凯，任雨，樊晓骁

作者单位： 315000 宁波，宁波市泌尿肾病医院

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）作为肿瘤坏死因子（TNF）超家族的一员，具有能够特异性识别肿瘤细胞表达的促凋亡TRAIL 受体（TRAILR）的能力，进一步使其在诱导肿瘤细胞凋亡的同时对正常细胞不造成损伤。这一特性使得TRAIL 成为新型抗肿瘤药物作用靶点的研究热点，但同时部分肿瘤细胞极易产生针对TRAIL的耐药性，使得其临床应用进展缓慢。因而，对肿瘤细胞TRAIL耐药性产生机制的研究及研究如何缓解这一耐药性是TRAIL相关治疗方案未来发挥其临床价值的关键。

1 TRAIL 及其受体

TRAIL 作为TNF 超家族（TNFSF）的一员于1995 年被Wiley 等[1]发现，也被称为TNF 超家族因子10（TNFSF10）和细胞凋亡配体2（Apo2L）。与TNF 和细胞凋亡配体1（Apo1L）等类似，作为TNFSF 一员的TRAIL 也同样拥有造成肿瘤细胞凋亡的能力，并且在诱导凋亡的同时，TRAIL对正常组织影响极小，这一特点使得TRAIL介导的抗肿瘤治疗受到广泛关注[2]。

根据现有研究进展，已发现的TRAIL 受体共有5 种，依据能否诱导细胞凋亡可分为两大类。一类是可使细胞凋亡诱导发生的TRAIL-R1 和TRAIL-R2，也分别被称为死亡受体4（DR4）和死亡受体5（DR5），这两者具有的共同特征即具有完整的死亡结构域（DD），使得这类受体与TRAIL 结合后可激活下游凋亡通路[3]。另一个受体类别包含TRAIL-R3、TRAILR4 和骨保护素（OPG）这三者，其中TRAIL-R3 和TRAIL-R4 也被称为诱骗受体（DcR），依次称为DcR1 和DcR2[4]。DcR1和DcR2 虽然也是膜受体，但在受体结构上与死亡受体差别较大，结构上的缺陷决定了这二者均无法激活凋亡通路。这一类受体与TRAIL结合不但无法发挥其促凋亡的生理功能，还会出现DcR与DR的竞争，进而导致DR 激活不充分，使诱导凋亡作用减弱[5]。而OPG 作为可溶性受体同样没有死亡结构域，其主要的生理功能为抑制破骨细胞的活动[6]。

2 TRAIL 诱导的凋亡信号通路

TRAIL 与DR4/DR5 结合后，使得死亡受体的胞内结构死亡结构域（DD）活化，而 Fas 相关死亡结构域蛋白（FADD）通过DD 实现了与DR 的结合，同时通过死亡效应结构域（DED）招募结合了同样具有DED 结构的胱冬肽酶原-8（procaspase-8）和procaspase-10。至此，上述所有因子构成了一个统一的总体结构，被称为TRAIL死亡受体复合物（DISC）[7]。无活性的procaspase-8 经过DISC 的激活和自活化成为有活性的胱冬肽酶-8（caspase-8）后，进入胞质中并进一步活化下游caspase-3，从而进一步导致细胞凋亡，这一通路过程被称为外源性凋亡通路，基于这一通路的细胞被称为I 型细胞。而在II 型细胞中，X 染色体连锁凋亡抑制（XIAP）蛋白的高表达使得caspase-3 活性遭到抑制，这使得单纯依靠外源性凋亡通路无法充分活化足够的caspase-3 诱导凋亡[8]。为了克服XIAP 对caspase-3 的抑制，一部分caspase-8 的生理功能转化为裂解活化BH3相互作用域死亡激动剂（BID），使其成为有活性的截短型BID（tBID），之后tBID 进入线粒体中进一步激活下游的BCL-2 关联蛋白X（BAX）与BCL-2 拮抗蛋白（BAK），这两者导致线粒体外膜通透性增强（MOMP）[9]。MOMP 触发下游机制，使得线粒体释放出第二线粒体衍生胱天蛋白酶激活剂（SMAC），SMAC 是XIAP 的一种自然抗体，可以消除XIAP 对caspase-3 活性的抑制[10]。同时，MOMP 也使得细胞色素c（cytochrome c）从线粒体中被释放出来，而后细胞色素c 与凋亡蛋白酶激活因子1（APAF1）和procaspase-9 一道共同构成了凋亡体（Apoptosome），并进而产生了caspase-9，caspase-9 能增强caspase-3 的活化程度，从而加强凋亡诱导[9]。上述需要线粒体介导的凋亡诱导通路即被称为内源性凋亡通路。

3 肿瘤细胞TRAIL耐药性的产生机制

通过对TRAIL 介导的细胞凋亡通路的研究发现，有效TRAIL 含量、TRAIL 受体情况以及信号通路相关蛋白表达情况均是影响TRAIL介导的细胞凋亡的关键点。从理论上讲，上述任意一方面出现异常，都是造成肿瘤细胞TRAIL耐药的可能因素。

3.1 TRAIL 活性对耐药性的影响TRAIL在人体中以同三聚体的形式发挥作用，但单纯的三聚体形态稳定性不足，容易被清除失活，导致诱导信号强度不足以发挥其促凋亡作用，继而产生TAIL耐药性[11]。TRAIL 耐药性的产生也与TRAIL 靶向性不足有关，难以在肿瘤局部形成充分效价，同时为达到有效治疗浓度需提高TRAIL的使用量，同时造成对肝肾器官的影响[12]。

3.2 TRAIL 受体对耐药性的影响TRAIL只有与DR结合后才能介导后续凋亡通路，已有研究表明，若肿瘤细胞DR表达不足，或DcR 表达过量，则导致即使在TRAIL充足的情况下仍无法充分介导凋亡通路诱导细胞凋亡，进而使肿瘤对TRAIL 的治疗出现耐药性[13]。同时研究表明部分肿瘤细胞存在网格蛋白依赖的胞吞作用（CME）及其介导的DR 胞吞现象，使得DR 尽管在mRNA 层面表达正常，但细胞表面的死亡受体仍偏少，导致细胞出现TRAIL 耐药性[14]。另有研究表明，细胞表面的死亡受体需要如糖基化（glycosylation）等进一步修饰才能实现富集及构建DISC的功能，若修饰不足，如相关酶缺乏，也会出现耐药性上升现象[15]。

3.3 信号通路因子对耐药性的影响在凋亡信号通路传导过程中，若促凋亡因子作用相对减少，或抗凋亡因子作用相对增强均有可能导致肿瘤细胞对TRAIL 的耐药性。例如BCL-2 家族中同时存在促凋亡因子BID、BAX 和BAK，以及抗凋亡因子BCL-2 和BCLB，这类抗凋亡因子通过抑制MOMP 的发生对细胞凋亡产生影响，已有研究表明两种凋亡因子表达失衡是肿瘤细胞产生TRAIL 抵抗的可能因素[16]。细胞型FADD样IL-1 转化酶（FLICE）抑制蛋白（c-FLIP）具有与caspase-8 高度同源的DED，可与caspase-8 在FADD 的结合上产生竞争，使得procaspase-8 无法活化[17]。同时有研究表明凋亡抑制蛋白（IAP）家族内的细胞型IAP 蛋白1（cIAP1）和cIAP2 等因子与前述的XIAP相似，可通过对caspase 活化的抑制来影响细胞凋亡[18]。另有研究表明，由于细胞凋亡的复杂性，除了上述TRAIL诱导凋亡通路相关因子的异常可导致TRAIL 耐药以外，还有其他凋亡通路因子如核因子- B（NF- B）[19]及Jun氨基末端激酶（JNK）[20]等均会对TRAIL耐药的产生造成影响。因此，对凋亡通路的研究是明确TRAIL耐药性产生的一大重点。

4 TRAIL 耐药性的缓解策略

通过对TRAIL耐药机制的研究，当前针对耐药性的缓解策略可分为三大类：第一类是对TRAIL进行修饰，通过在TRAIL上修饰基团或载体提高TRAIL 的稳定性和靶向性；第二类是采用DR 的激动型抗体与DR结合，并激活凋亡通路；第三类是将TRAIL 与其他物质联合使用来提高肿瘤细胞对TRAIL 治疗的敏感性。

4.1 经修饰的TRAIL 已有学者通过修饰聚组氨酸（poly-histidine）和FLAG抗原表位（FLAG epitope）等基团增强TRAIL 三聚体的稳定性；或添加具有靶向性的基团，如对应抗原的IgG抗体，获得了较好的抗肿瘤效果[21]。除上述修饰基团的策略以外，将TRAIL与载体进行结合来提高稳定性和靶向性也是一大研究方向。De Miguel 等[22]通过将TRAIL修饰到脂质体纳米微粒的表面，发现其能在淋巴瘤细胞表面诱导出足够DR5的表达与聚集，进而强化了DISC的产生和凋亡的发生。也有研究人员使用金纳米颗粒作为载体成功提高TRAIL敏感性，其机制可能为发动蛋白相关蛋白1（Drp1）表达增强，进而导致线粒体裂解[23]。部分学者考虑到免疫反应及纳米微粒作为外来异物的抗原性，提出使用诸如人血白蛋白（HAS）等人体自身蛋白以及人体细胞作为载体来提高TRAIL 的稳定性和有效性的想法，拓展了TRAIL载体的研究方向[24-25]。

4.2 死亡受体的激动剂 除修饰TRAIL 思路外，也有研究者考虑构建高效稳定的激动剂直接活化DR 诱导凋亡。但目前研究表明，单纯使用DR 激动剂效果提升并不明显，如Ciuleanu 等[26]对肝细胞癌患者进行了基于一种DR4 受体激动剂（mapatumumab）的二期临床试验，发现并不能有效提升患者的无进展生存期。基于此，构建可激活多个受体的联合激动剂是当前的进展方向，如Brünker 课题组构建了针对DR5 和成纤维细胞活化蛋白（FAP）的联合激动抗体RG7386，在抗肿瘤效应方面较单抗体有了明显的提升[27]。而Satta 等[28]构建了CD3-DR5 联合抗体，在活化TRAIL 相关细胞凋亡的同时，活化T 细胞启动细胞免疫，提高了肿瘤细胞的杀灭效果。

4.3 TRAIL 的联合用药 将TRAIL 与化学药物、生物提取物等联用也是当前破解TRAIL耐药性的研究热点，作用机制主要集中在对死亡受体的调节以及信号通路的影响。有学者将姜黄素与TRAIL 联合应用后发现，与TRAIL 单用相比，二者联用可显著提高肿瘤细胞DR4与DR5 的表达，同时对c-FLIP、MCL-1及XIAP 等抗凋亡因子产生抑制作用，进而提高了TRAIL 的凋亡诱导效果[29]。中药木兰属提取物和厚朴酚（Honokiol）同样被发现具有增强TRAIL 敏感性的功能，其作用机制经研究表明主要是对抗凋亡蛋白c-FLIP和生存素等的抑制，使TRAIL诱导的凋亡增强[30]。紫草科提取物乙酰紫草素（Acetylshikonin）也被证实可通过ROS家族活化p53/PUMA/BAX通路后增强肝细胞癌对TRAIL 治疗的敏感性[31]。上述研究表明对中医药的进一步研究可有助于新型抗肿瘤疗法的发现。

在化学药物方面，Uddin等[32]发现一种蛋白磷酸酶2A（PP2A）抑制剂LB-100可有效抑制三阴乳腺癌细胞对TRAIL的耐药性，PP2A被证明通过影响蛋白激酶B（PKB）使肿瘤细胞产生TRAIL 耐药性。硼替佐米作为多发性骨髓瘤治疗的一线药物，基于人胃癌细胞株的实验表明，其通过活化细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）提高细胞表面DR5 的表达，其增强了TRAIL 诱导凋亡的效果[33]。甲状腺未分化癌虽然罕见，但患者预后极差，而维莫非尼与TRAIL 的联用方案在细胞和动物模型上均取得了良好的抑瘤效果，显著提高了TRAIL治疗的敏感性[34]。

5 结语

TRAIL因其具有针对肿瘤细胞的特异性杀伤能力而受到广泛研究，但自身结构的不稳定性及个别肿瘤易对其产生耐药性，TRAIL 相关治疗手段的临床应用仍很困难。随着对TRAIL 致凋亡机制及耐药机制的深入研究，如何缓解TRAIL 耐药性的方法越来越多样，从构建重组TRAIL 聚合体到开发死亡受体激动剂，再到构建TRAIL联合用药体系都各有亮点。虽然目前来看单一缓解策略仍无法全面解决TRAIL 治疗存在的不足，对TRAIL耐药机制的产生由于肿瘤细胞的差异仍有许多未知区域等待进一步探索，但当前多个研究道路的开辟仍为将来把TRAIL 相关治疗方案应用于临床实践提供了理论依据。如果未来随着后续研究的进一步深入，TRAIL 相关治疗最终能应用于临床，这将为肿瘤的治疗提供重要手段。