“大红袍挥发油中柠檬烯含量测定”简化实验教学*

解子仪 刘芯莹 宁安琪 逯佩玉 邵亚洲 梁俊玉

（西北师范大学生命科学学院 甘肃兰州 730070）

大红袍（Zanthoxylum bungeanumMaxim）为花椒属植物的一种，挥发油含量丰富[1]。大红袍挥发油中存在一种主要成分——柠檬烯（limonene），气味类似柠檬的香味，功能众多，包括抗菌抑菌、杀虫杀螨、防腐保鲜等。柠檬烯在食品药品、日化领域应用广泛[2-3]。本实验以甘肃省陇南市产的大红袍为材料，提取大红袍挥发油，测定挥发油中柠檬烯的百分含量。通过分析实验难点，调整实验方案，使实验各个操作环节安全可控，学生只要以严谨的科学态度，认真仔细操作每一步骤，易获得可靠结果，适合作为中职院校的生物学实验教学。

1 探究实验难点

在实验目的上，多数文献为探究柠檬烯在大红袍中的百分含量。以文献《基于GC-MS技术对甘肃陇南大红花椒挥发油柠檬烯芳樟醇含量的测定》和《花椒挥发油的提取及其抑菌抗虫活性测定》为例[4-5]。实验内容存在难点：1）需选用不同溶剂提取大红袍挥发油，并比较挥发油颜色、状态、气味；2）分别计算大红袍挥发油的提取率；3）选择呈黄色透明油状有单纯花椒气味，且提取率高的溶剂进行实验。但由于中职学生较难把握判断标准，且实验时间有限，故实验不易于实施。

2 简化方案及效果

笔者尝试调整实验思路，明确实验目的为“探究柠檬烯在大红袍挥发油中的百分含量”。学生只需完成3个环节，即大红袍挥发油的提取、气质联用仪测定柠檬烯含量、归一化法确定柠檬烯百分含量。首先，测定柠檬烯的含量是相对挥发油的含量而言，无需计算大红袍的提油率；其次，采用水蒸气蒸馏法提取大红袍挥发油，不涉及对多种提取溶剂的比较。简化后的实验要求，符合中职学生的实际操作能力，易于在生物学实验课堂实施。

2.1 实验目的 通过查阅资料，展开合作探究性学习，使学生理解提取挥发油的原理，掌握提取挥发油的操作方法和注意事项；学会使用气质联用仪等实验设备；并对实验课堂产生兴趣，对大红袍有效成分的药用价值产生研究热情。

2.2 实验材料与仪器

1）试剂：乙醚、正己烷、柠檬烯标准品（20 mg）、蒸馏水。

2）仪器：气质联用仪、微孔滤膜、20 目分选筛子、粉碎机、滤纸、挥发油提取器、圆底烧瓶、锥形瓶、容量瓶、冷凝管、纱布、沸石、电热套。

3）材料准备：选用产自甘肃陇南的大红袍干燥的果皮。称取大红袍样品100 g 粉碎，过20 目筛，装入2 000 mL 的圆底烧瓶中，加800 mL 蒸馏水及沸石，浸泡过夜。

2.3 实验流程

1）标准品制备[6]：精密称取20 mg 柠檬烯，置于5 mL容量瓶中，用正己烷定容，即得柠檬烯标准品。

2）挥发油提取：如图1所示，搭建提取挥发油装置。在挥发油测定器中加入蒸馏水至溢流入圆底烧瓶中，电热套上加热圆底烧瓶，温度为120℃，蒸馏4 h，冷却。从挥发油测定器中放出所提取的大红袍挥发油，转移至分液漏斗，加少许乙醚萃取并过滤，常温下挥干乙醚，得芳香油，为黄色且有特殊香味。取挥发油30 μL，加正己烷定容至10 mL，再用微孔滤膜过滤，即得柠檬烯供试品[7]。

图1 大红袍挥发油提取装置

3）气质联用仪测定[8]：①测定前：设置氦气压力为0.5 MPa，流速为1.0 mL/min。②测定时：色谱条件，初始温度60℃，程序升温，从10℃/min 速率升至180℃；待1 min 后，以20℃/min 升至280℃，保持5 min；进样量1 μL（用正己烷稀释至1%），分流比为10∶1 进样；汽化室温度为250℃；质谱条件，电压70 eV，温度230℃; 扫描范围20～200 m/z。③测定后：数据比较NIST 和WILEY 库及文献中记录的化合物进行鉴定，得出柠檬烯的含量。

4）标准曲线制备：精密吸取上述对照品母液加正己烷稀释，得系列浓度梯度。按上述色谱条件分别进样，以进样量对峰面积积分值进行回归处理，得柠檬烯标准曲线。柠檬烯回归方程为y=（5×108）x-2×107，R2=0.9996。

2.4 实验结果与分析 本次实验将20 人分为3 组进行实验，实验结果均较好且差异不大，以其中一组数据进行分析。图2为大红袍挥发油TIC（total ions chromatograph）,即总离子流图，由图可知，大红袍挥发油的分离正确；图3和图4为质谱与NIST 和WILEY 对照，通过与柠檬烯标准品对照，确定大红袍挥发油中含有柠檬烯的成分。

图2 大红袍挥发油总离子流图

图3 柠檬烯标准品质谱图

图4 柠檬烯样品质谱图

表1为3 个小组的数据汇总，通过归一化法，根据气相色谱峰面积，确定柠檬烯在挥发油中的含量。从计算的数据分析，3 组学生操作得当。最终的实验结果为，甘肃陇南大红袍挥发油中柠檬烯含量为24.95%。

表1 大红袍挥发油中柠檬烯的含量

2.5 实验注意事项

1）挥发油提取：电热套接触的玻璃器皿应保持干燥，否则电热套易短路；冷凝水流速适中，以不烫手为原则；冷凝管要“下管进水、上管出水”。

2）柠檬烯测定：注射器每次进样后要及时清洗，并擦干针头；进样保持进针竖直，进入后快进快出。

3 反思

3.1 注重学生现有实验水平，合理设计实验方案实验的顺利进行，依靠教师对实验方案的精心设计，而学生现有的实验水平，则是教师展开教学设计的基础。目前，中职学生操作的独立性和实践的创新性不强，实验基础较薄弱。据此，本实验调整实验思路，明确“探究柠檬烯占大红袍挥发油的百分含量”为实验目的，精减实验内容，减少操作环节，适合学生以合作探究的方式完成实验，增强学习兴趣与信心。

3.2 教师适时引导，培养学生思考能力 思考能力与实验能力密切相关，做实验应手脑并用，不假思索的机械操作将无法提高实验水平，思考能力制约着学生实验水平的发展，在实验教学中“如何培养学生的独立思考能力”是每一位生物学教师必须思考的问题。本实验中，教师多次提出问题，引导学生思考，鼓励学生自己找寻答案，例如，在提取大红袍挥发油时，教师展示2 种挥发油提取装置，并提问哪个装置适于本实验？由学生思考后给出答案，教师再针对学生回答情况进行总结，逐步培养学生独立思考的习惯。

3.3 培养学生科学素养，提升实验教学价值 生物学实验教学具有直观性、实践性和激发性，是培养学生科学素养的重要环节之一。实验前，学生能直观感受大红袍的结构特征，以此丰富感性知识；实验过程中，学生亲身实践，锻炼自身实验操作能力；实验后，通过对实验数据的分析，学生了解大红袍所具有的研究价值，进而激发学生对植物源中单体成分的研究兴趣，提高动手能力和解决问题的能力，培养学生的生物学科学素养。