细胞学p16INK4a检测在宫颈癌初筛与早期诊断中的意义

陈春丽，沈 力，沈梦露，王婷婷，邓鑫州*

[1.湖北省十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院) 肿瘤科，湖北 十堰442000；2.湖北医药学院基础医学院 生物化学教研室，湖北 十堰442000]

宫颈癌是导致中青年女性癌症患者死亡重要原因[1]。p16INK4a与宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌的发生发展具有紧密的联系，p16INK4a蛋白的表达水平能够有效反映机体感染HR-HPV后对DNA整合状态、致瘤风险的大小以及癌基因的表达活性[2-4]。因此，作为新一代的子宫颈细胞学检查方法，p16INK4a免疫细胞化学染色技术有潜力成为优选女性宫颈癌筛查方法，为早期宫颈癌诊断提供重要帮助。本研究通过比较p16INK4a免疫细胞化学染色、宫颈薄层液基细胞学检查(TCT)及高危人乳头瘤病毒(HR-HPV)检测对宫颈癌筛查的结果，旨在评价p16INK4a染色作为人群宫颈病变初筛及早期诊断宫颈癌的可行性及有效性。

1 资料与方法

1.1 研究对象于2019年2月至2019年12月招募湖北十堰地区1927例女性作为研究对象。纳入标准：①年龄在25-50岁，有性生活史；②既往无宫颈病变或宫颈癌病史；③既往未行子宫放疗或宫颈切除手术。排除标准：①合并生殖内分泌系统疾病；②全身基础条件差，合并其他系统的严重疾病。所有受检者均签署知情同意书，并接受宫颈HR-HPV检测、TCT、p16INK4a检查。本项目经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1宫颈细胞学检查 采集样本利用AutoCyte制片机(TriPathImaging公司，美国)制成宫颈脱落细胞液基薄片，经染色后封片。阅片标准为2001版Bethesda阴道或宫颈细胞学诊断的系统[5]。当结果TCT高于低级别鳞状上皮内病变(LSIL)/不典型腺细胞(AGC)为阳性。

1.2.2高危HPV检测 采用CobasX480核酸自动提取仪和CobasZ480扩增分析仪(Roche公司，美国)进行检测，通过全自动样品制备与即时PCR扩增技术得到HPV16型、18型、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68的混合结果。

1.2.3p16INK4a免疫细胞染色 利用p16INK4a蛋白单克隆鼠抗人抗体(森盈生物科技有限公司，深圳)进行多聚螯合物酶法染色。在光学显微镜下可见p16INK4a位于细胞核及细胞质内，呈深棕色和棕黄色。发现p16INK4a着色的细胞≥1个即为阳性。染色结果见图1。

图1 p16INK4a阴性(左)，p16INK4a阳性(右)，×100倍

1.2.4阴道镜活检病理诊断 初筛时任一项目结果阳性即需接受阴道镜下宫颈管搔刮加四象限定点加随机活检(POI)方案活检。诊断标准参照2017版中国宫颈癌筛查及异常管理相关问题专家共识[6]。

1.3 统计学方法应用SPSS25软件处理数据。率的比较采用卡方检验、Fisher确切概率法。不同方法识别CIN的灵敏度、特异度的差异比较采用McNemar检验。阅片医师判读p16INK4a和TCT检测结果的一致性通过计算Kappa值进行比较，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 总体筛查结果完成筛查人群共计1927例，任一筛查项目为阳性者比率为13.91%(268/1927)，其中p16INK4a阳性率7.06%(136/1927)，TCT阳性率为4.77%(92/1927)，HR-HPV阳性率8.46%(163/1927)。首筛阳性人群中回叫应答率为83.21%(223/268)，均接受阴道镜检查，病理诊断结果176例为非CIN(单纯HPV感染或慢性宫颈炎)，27例为CIN1期病变，11例为CIN2期病变，9例为CIN3期病变。

2.2 不同级别宫颈病变不同检测方法的阳性率比较根据病例诊断结果将首筛阳性的患者分为非CIN组、低级别病变组(CIN1期)和高级别病变组(CIN2期、3期)。在非CIN组中p16INK4a阳性率高于TCT阳性率(χ2=5.142，P=0.029)，低于HR-HPV的阳性率(χ2=6.372，P=0.016)；在低级别病变组中p16INK4a的阳性率与TCT和HR-HPV检测相近，差异无统计学意义(P>0.05)，而在高级别病变组，p16INK4a阳性率也与TCT和HR-HPV检测相近，差异无统计学意义(P>0.05)。此外，以非CIN组、低级别病变组和高级别病变组为序，p16INK4a的阳性率明显提高，随着CIN病变级别的提高呈现出趋势性增加(χ2=9.074，P=0.002)，详见表1。

表1 不同筛查方法阳性率的比较[n(%)]

2.3 p16INK4a与TCT阅片结果一致性比较共有1595例p16INK4a、1768例TCT标本由两位阅片经验丰富的高年资病理学医师进行独立盲法阅片。对p16INK4a结果判读的阴性一致率、阳性一致率和整体一致性均明显高于TCT(P<0.001)，其中对TCT阅片结果的Kappa值为0.573，而对p16INK4a阅片结果的Kappa值为0.944，详见表2。

2.4 p16INK4a、TCT以及HPV检查在宫颈癌筛查中的效能比较在排除45例首筛阳性但未接受阴道镜检查明确诊断的患者，最终纳入1882例受检者进行筛查效能分析。p16INK4a、TCT及HR-HPV检测筛出CIN病变的的灵敏度分别为82.98%(39/57)、74.47%(35/57)和87.23%(41/57)，特异度依次为85.78%(1574/1835)、74.93%(1365/1835)和86.76%(1592/1835)。其中灵敏度p16INK4a与HR-HPV均明显大于TCT(P<0.05)，但二者间无明显差异(P>0.05)，而特异度p16INK4a与TCT明显大于HR-HPV(P<0.05)，但二者间无明显差异(P>0.05)。

表2 p16INK4a与TCT检查结果判读一致性比较(%)

3 讨论

TCT与HR-HPV检测是目前宫颈癌筛查的主要方法,其中HR-HPV检测应用最为广泛，具有较高的敏感性，但是特异度低，可能会产生过度干预或者不必要的阴道镜转诊，提高了医疗成本，并有可能引起受检者的焦虑紧张情绪[7]；而TCT检查的敏感度相对较低，由于判读具有主观性，结果容易因阅片医师的不同而产生差异，可能会导致误诊漏诊，对技术人才的依赖性也较高，在资源匮乏的地区难以实现大范围的筛查工作[8]。因此，临床上亟待改进宫颈癌的筛查方法，通过探寻更精确有效而又客观易行的生物学标志物来对宫颈癌的筛查方案进行优化十分必要。

p16INK4a能够判断机体是否因HPV感染而影响宫颈细胞周期调控[9]。与传统宫颈癌筛查方法相比，通过对子宫颈脱落细胞进行p16INK4a免疫细胞染色，能够根据细胞着色结果进行判读，而不仅仅依靠细胞的形态，因此最大限度地降低了主观因素带来的偏倚[10]。因此p16INK4a检查经过短期的系统培训即可阅片，对病理医师诊断经验的要求较低。另一方面，虽然HR-HPV检测能够筛查出宫颈病变的患者，但目前尚无足够的证据表明其能反映病变的程度[11]。而Wu等[12]则发现，p16INK4a染色能够有效地鉴别低级别与高级别的CIN。在本次研究中，随着宫颈病变程度的加重，p16INK4a的阳性率明显呈现出上升趋势。p16INK4a染色能够对HR-HPV持续感染的细胞进行定位，进一步对阳性细胞的形态进行观察判断，能够很大程度地增强甄别不典型细胞的能力，从而提高筛查的准确率。在非CIN组中p16INK4a阳性率低于HR-HPV的阳性率，但高于TCT阳性的比率，而在低级别和高级别病变组中p16INK4a的阳性率与TCT和HR-HPV检测相近，同样能够准确发现可能发生的病变风险。

为了验证本研究中免疫细胞染色p16INK4a作为筛查宫颈癌的生物学标志物的稳定性，本次研究对两名经验丰富的高年资阅片医师的结果进行了分析，结果显示二者的p16INK4a判读结果无论是阴性还是阳性的样本判读的一致性都很高，明显大于对TCT判读的阳性一致率，进一步证明了p16INK4a染色结果判读具有客观性和可重复性，受阅片医师的影响很小。在既往报道中，有学者也通过两名医师对宫颈癌筛查细胞学Ki-67/p16双染结果进行判读，其阳性、阴性、整体一致性的Kappa值分别为0.641、0.629以及0.612[13]。而另一项研究中，通过7名医师对HPV阳性女性的细胞样本Ki-67/p16双染结果进行判读，整体一致性的Kappa值为0.74[14]。

本研究还对p16INK4a筛查识别高级别宫颈病变的特异度及灵敏度进行了分析，分别为95.3%和90.0%，与TCT灵敏度和HR-HPV检测阳性的特异度均无明显差异。近来欧洲一项大型横断面临床研究中，通过招募27349名女性进行HPV检测、巴氏细胞学检查和p16INK4a/Ki-67双染检测，结果显示p16INK4a/Ki-67双染在识别CIN2期病变和CIN3期病变时的特异度为95.2%和94.8%，与巴氏细胞学检查相当(95.4%和95.1%)，但是p16INK4a的识别灵敏度却明显高于巴氏细胞学检查(86.7% vs 68.5%和87.4% vs 73.6%)[15]，说明p16INK4a能够更加精准地对人群宫颈病变情况进行筛查，尤其是在细胞学检查尚不发达的地区，p16INK4a染色可能是TCT的有效替代方案。

综上所述，本研究认为p16INK4a染色在以人群为基础的宫颈癌初筛中对宫颈病变识别特异度与TCT相当，敏感度与HR-HPV检测相当，在宫颈癌的早期识别中具有一定优势。p16INK4a染色作为新一代宫颈细胞检查技术，其结果易判读，可重复，客观性强，兼具高特异度与高敏感性，有潜力成为大范围人群普筛与精确转诊的优选技术。并且，p16INK4a染色简捷快速、成本较低，符合我国国情，适合在广大基层医疗机构中实施，但由于本研究仅为横断面研究，具有一定局限性，将来需纳入更大样本量进行长期的前瞻性研究，从而进一步评估p16INK4a染色对于宫颈病变转归及预后的预测作用。