乳腺癌组织AGR-2的表达及其临床意义

范小庆　周国凤　陶珊珊　熊秋云

【摘要】 目的：探討AGR-2蛋白在乳腺浸润性癌组织中的表达及其与临床病理分子分型特征之间的关系。方法：收集2020年1-8月本院手术治疗的150例乳腺浸润性导管癌患者的临床资料。应用免疫组织化学EliVison二步法检测150例乳腺浸润性导管癌组织的精氨酸酶-2（AGR-2）、人表皮生长因子受体2（HER2）、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和细胞增殖指数（Ki-67）的表达，分析AGR-2在乳腺浸润性癌组织中的表达水平，及其与乳腺癌患者临床病理分子分型指标的关系。结果：在150例乳腺癌组织中，AGR-2蛋白低表达者92例，高表达者58例;而对应的150例癌旁组织中AGR-2蛋白均为低表达。乳腺癌组织学分级高者AGR-2表达水平高于组织学分级低者，淋巴结有转移者AGR-2表达水平高于淋巴结无转移者，ER阴性者AGR-2表达水平高于ER阳性者，Ki-67高表达者AGR-2表达水平高于Ki-67低表达者，差异均有统计学意义（P<0.05）。AGR-2蛋白表达水平在患者的年龄、肿瘤大小、PR及HER2状态间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：AGR-2蛋白在乳腺浸润性癌中有较高表达，AGR-2高表达与组织学分级、淋巴结转移、ER、Ki-67的表达有关，但与乳腺癌的生存预后关系有待进一步研究。

【关键词】 乳腺癌 AGR-2蛋白 淋巴结转移 ER

Expression of AGR-2 in Breast Cancer and Its Clinical Significance/FAN Xiaoqing， ZHOU Guofeng， TAO Shanshan， XIONG Qiuyun. //Medical Innovation of China， 2021， 18（15）： -123

[Abstract] Objective： To investigate the expression of AGR-2 protein in breast cancer， and its relationship with clinicopathologic and molecular features. Method： The clinical data of 150 cases of invasive ductal carcinoma of breast treated by our hospital from January to August 2020 were collected. The expression of arginase-2 （AGR-2），

human epidermal growth factor receptor 2 （HER2）， estrogen receptor （ER）， progesterone receptor （PR） and cell proliferation index （Ki-67） were detected by two-step immunohistochemistry （EliVison）. The expression level of AGR-2 in invasive breast cancer tissue and its relationship with the clinicopathological molecular classification index of breast cancer patients were analyzed. Result： In 150 cases of breast cancer， the expression of AGR-2

protein was low in 92 cases and high in 58 cases. The expression of AGR-2 protein was low in 150 adjacent tissues. The expression level of AGR-2 in breast cancer with high histological grade was higher than that with low histological grade， the expression level of AGR-2 in patients with lymph node metastasis was higher than that in patients without lymph node metastasis， the expression level of AGR-2 in ER negative patients was higher than that in ER positive patients， the expression level of AGR-2 in Ki-67 high expression group was higher than that in Ki-67 low expression group， the differences were statistically significant （P<0.05）. There were no significant differences in the expression level of AGR-2 protein among patients’ age， tumor size， PR and HER2 status （P>0.05）. Conclusion： AGR-2 protein is highly expressed in invasive breast cancer. The high expression of AGR-2

is related to histological grade， lymph node metastasis， ER and Ki-67 expression， but its relationship with survival and prognosis of breast cancer needs further study.

[Key words] Breast cancer AGR-2 Lymph node metastasis ER

First-author’s address： Third Municipal Hospital， Nanchang 330009， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.15.029

乳腺癌发病率逐年升高，已经成为女性最常见的恶性肿瘤，尽管乳腺癌的治疗取得了巨大的进步，但由于其生物学特性复杂、复发转移率高，约30%以上的患者死于复发和远处转移[1-2]。因此，更深入地研究与乳腺癌发生发展相关的因子及分子机制对乳腺癌的早期诊断、疗效预测和预后判断具有重要意义。

精氨酸酶-2（arginase-2， ARG-2）是一种双核含锰的金属酶，基因定位于染色体14q24.1～24.3，广泛分布于脑、乳腺、前列腺和肾脏等脏器，在生物体的新陈代谢中起着十分重要的作用，并能调节机体免疫功能[3-6]。有研究表明，ARG-2在人类多种恶性肿瘤中呈异常表达，与癌症有着密切的关联，然而ARG-2在乳腺癌组织中的表达和意义尚不明确[7-8]。为此，本课题旨在研究ARG-2在人乳腺浸润性癌中的表达情况，探讨其与乳腺癌临床病理分子分型和预后的相关性。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2020年1-8月本院手术治疗的150例乳腺浸润性导管癌患者的临床资料。（1）纳入标准：①女性;②可手术;③经常规石蜡切片病理确诊为乳腺浸润性导管癌;④進行了前哨淋巴结活检;⑤术前未接受过化疗、内分泌治疗和放疗。（2）排除标准：①妊娠或哺乳期;②合并其他部位的恶性肿瘤。本研究得到患者的知情同意和医院伦理委员会批准。

1.2 方法 免疫组织化学实验及结果判定：采用EliVison二步法进行免疫组织化学检测，具体步骤参照免疫组织化学试剂盒（上海基因科技有限公司）说明书进行。对所有乳腺癌患者的AGR-2、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子受体2（HER2）和细胞增殖指数（Ki-67）表达进行检测，所有标本经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm连续切片。阴性对照用PBS代替一抗，用正常乳腺上皮组织作阳性对照。主要试剂：AGR-2购自美国Epitomics公司，ER、PR、HER2、Ki-67及相关试剂盒均购自北京中杉生物技术有限公司。由两位中级以上病理师采用双盲法评定染色结果。

1.3 观察指标与判定标准 观察AGR-2、ER、PR、HER2及Ki-67在乳腺浸润性癌组织中的表达，分析AGR-2的表达与年龄、肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移等临床病理学的关系，及其与ER、PR、Ki-67和HER2表达的相关性。（1）AGR-2蛋白阳性反应为棕黄色颗粒定位于细胞膜和细胞质，由两位中级以上病理医师采用双盲法评定染色结果。每张切片在400倍放大光学显微镜下随机选择5个视野，计数1 000个癌细胞，计算染色细胞阳性率。采用半定量积分法对癌细胞染色强度和染色细胞阳性率进行评分。染色强度分为4个等级：棕褐色为3分，棕黄色为2分，浅黄色为1分，无着色为0分[9]。染色细胞阳性率分为5个等级：81%～100%为4分，51%～80%为3分，11%～50%为2分，1%～10%为1分，无染色细胞为0分[10]。将两组评分相乘所得值，分为2个等级：0～4分为低表达，5～12分为高表达。（2）ER和PR阳性判断标准：肿瘤细胞无细胞核棕黄染色或<1%的细胞核较弱棕黄染色为阴性，≥1%的细胞核棕黄染色则为阳性。（3）HER2阳性判断标准：细胞膜棕黄染色为阳性。无细胞染色或<10%的细胞膜较弱染色为（-）;>10%的细胞膜部分较弱染色为（+）;>10%的细胞膜完全较弱到中等染色为（++）;>10%的细胞膜完全强染色为（+++）[11-13]。对HER2（++）者进一步进行FISH检测。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用χ检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者的一般资料 共获得150例乳腺癌患者的临床病理资料（包括癌及癌旁组织）。年龄29～68岁，中位年龄48岁，年龄≤35岁者28例（18.7%），>35岁者122例（81.3%）。肿瘤≤2 cm者45例（30.0%），>2 cm者105例（70.0%）。

2.2 AGR-2蛋白的表达与乳腺癌临床病理指标的关系 乳腺癌组织学分级高者AGR-2表达水平高于组织学分级低者，淋巴结有转移者AGR-2表达水平高于淋巴结无转移者，ER阴性者AGR-2表达水平高于ER阳性者，Ki-67高表达者AGR-2表达水平高于低表达者，差异均有统计学意义（P<0.05）。AGR-2蛋白表达水平在患者的年龄、肿瘤大小、PR及HER2状态间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.3 AGR-2蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达情况 应用免疫组织化学法检测AGR-2在150例乳腺癌及其对应癌旁乳腺组织中的表达情况，结果显示：AGR-2阳性信号定位于细胞质;在150例乳腺癌组织中，AGR-2蛋白低表达者92例，高表达者58例;而对应的150例癌旁组织中AGR-2蛋白均为低表达。因此，AGR-2在乳腺癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织，见图1。

3 讨论

AGR-2是一种线粒体酶，基因定位于染色体14q24.1-24.3，广泛分布于脑、肺、肝脏、前列腺和肾脏等脏器，其主要功能是促进人体新陈代谢，并调节免疫功能等[14-16]。有研究表明，AGR-2的异常表达与癌症有着密切的关联，在前列腺癌、肺癌、肝癌等肿瘤组织中高水平表达，其在肿瘤发生、发展中的角色成为新的研究热点[17-18]。为了评定ARG-2对于人类癌症的影响，该研究分析了超过2 000例欧美乳腺癌人群中的ARG-2表达水平，结果发现ARG-2高表达于特定乳腺癌类型，并与患者不良生存结局密切相关[19-21]。

本研究结果显示，AGR-2在乳腺浸润性癌组织中也存在异常表达，其表达水平在乳腺癌组织中明显高于乳腺正常组织，且AGR-2表达强度与乳腺癌的组织学分级呈正相关，提示AGR-2可能与乳腺癌的不良生物学行为有关。乳腺浸润性癌组织中AGR-2表达与细胞增殖标志物Ki-67表达正相关，间接提示了AGR-2异常表达可能参与了调节乳腺癌肿瘤细胞的增殖过程。研究结果发现，淋巴结转移组AGR-2蛋白阳性表达高于淋巴结阴性组，因此提示 AGR-2蛋白在乳腺浸润性癌组织中高表达与淋巴结转移、TNM分期正相关。ER阴性、HER2过度表达的乳腺癌患者预后较差已成定论，本研究免疫组化检测结果显示，ER表达阴性者AGR-2表达显著高于ER表达阳性者，而HER2过表达者AGR-2表达显著高于HER2阴性者，因此推断AGR-2高表达可能与乳腺浸润性癌患者的预后较差有相关性。

临床上根据乳腺癌ER、PR、HER2和Ki-67分子表达特征将乳腺癌分成4种亚型：导管型（Luminal型：ER+/PR+），预后良好、HER2过表达型（ER-、PR-、HER2+）、三阴型（TN型：ER、PR-、HER2-），预后较差。本组研究中Luminal型87例（58%），HER2过表达型34例（22.7%），三阴型29例（19.3%），其比例与文献[19-21]报道的类似，进一步研究发现不同的乳腺癌亚型的AGR-2蛋白表达有一定区别，三阴型显著高于Luminal型（P=0.01），可以推测AGR-2高表达可能与三阴型的乳腺癌患者预后较差有相关性。

本研究结果提示ARG-2蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中有较高的表达，AGR-2高表达与乳腺癌的增殖、分化、淋巴结转移及TNM分期有着密切关系，ARG-2在评估乳腺癌侵袭性的及预测肿瘤的复发转移方面具有一定的参考意义，但由于目前尚缺乏统一的ARG-2检测标准和评估方案，ARG-2能否成为乳腺癌新的预测因子或治疗靶点需要进一步研究。

参考文献

[1]刘学飞，李文会，辛彦.Numb和α-atenin蛋白在胃癌中的表达及其临床病理意义[J].国际肿瘤学杂志，2015，42（12）：896-899.

[2]洪健，何路，周新科.NUMB表达对肝细胞癌患者预后的影响[J].广西医学，2013，35（7）：813-816.

[3]司马晋，张保，马鑫，等.Numb基因对膀胱癌细胞侵袭和迁移能力的影响及机制研究[J].中华泌尿外科杂志，2014，35（3）：226-229.

[4] Pece S，Serresi M，Santolini E，et al.Loss of negative regulation by AGR-2 over Notch is relevant to human breast carcinogenesis[J].J Cell Biol，2004，167（2）：215-221.

[5]敬宏，牛晓宇，陈亚丽，等.AGR-2蛋白在上皮性卵巢癌中的表达及其与CD117、CD113、ALDH1的关系[J].四川大学学报（医学版）2016，47（6）：878-882.

[6] Hong J，Liu Z，Zhu H，et al.The tumor suppressive role of AGR-2 isoform 1 in esophageal squamous cell carcinoma[J].Oncotarget，2014，5（14）：5602-5614.

[7] Lu Y，Xu W，Ji J，et al.Alternative splicing of the cell fate determinant AGR-2 in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology，2015，62（4）：1122-1131.

[8] Mine T，Matsueda S，Li Y，et al.Breast cancer cells expressing stem cell markers CD44+ CD24 lo are eliminated by AGR-2-1 peptide-activated T cells[J].Cancer Immunol Immunother，2009，58（8）：1185-1194.

[9] Li Y，Wang W，Liu Z，et al.AGR2 diagnostic value in nasopharyngeal carcinoma prognosis[J].Clin Chim Acta，2018，484：323-327.

[10]龐晓庆，周永江，田小庆.AGR2、CD3在卵巢交界性肿瘤鉴别诊断中的价值分析[J].现代肿瘤医学，2021，29（5）：851-855.

[11] Raimondi M，Marcassa E，Cataldo F，et al.Calpain restrains the stem cells compartment in breast cancer[J].Cell Cycle，2016，15（1）：106-116.

[12] Kim S Y，Hong C，Wie J，et al.Reciprocal positive regulation between TRPV6 and AGR-2 in PTEN-deficient prostate cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2014，447（1）：192-196.

[13] Rennstam K，MeMichael N，Bcerglund P，et al.AGR-2 protein expression correlates wih a basal-like phenotype and cancer stem cell makers in primary breast cancer [J].Breast Cancer Res Treat，2010，212（2）：315-324.

[14] Jianchao Zhang，Ximing Shao，Haiyan Sun，et al.AGR-2 negatively regulates the mesenchymal transition of triple-negative breast cancer by antagonizing Notch signaling[J].Oncotarget，2016，7（38）：61036-61053.

[15]邱依然，刘文佳，余岳，等.AGR2在乳腺癌中的表达及其功能的生物信息学初步分析[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2020，27（3）：302-308.

[16] Saha S K，Choi H Y，Kim B W，et al.KRT19 directly interacts with β-catenin/RAC1 complex to regulate AGR-2-dependent NOTCH signaling pathway and breast cancer properties[J].Oncogene，2017，36（3）：332-349.

[17]范小庆，陶姗姗，熊秋云，等.Numb蛋白在乳腺癌组织的表达及其临床病理相关性分析[J].中国医学创新，2017，14（23）：25-28.

[18]陈敬佩，唐上坤，肖华.三阴性乳腺癌与HER-2过表达型乳腺癌MRI动态增强及弥散加权成像特征分析[J].中國医学创新，2017，14（8）：17-20.

[19] Zelli V，Compagnoni C，Capelli R，et al.Circulating MicroRNAs as Prognostic and Therapeutic Biomarkers in Breast Cancer Molecular Subtypes[J].JPM，2020，10（3）：98.

[20]钱章君.曲妥珠单抗辅助治疗HER-2阳性早期乳腺癌的心脏安全性研究[J].中外医学研究，2017，15（10）：37-39.

[21]倪亚平，陈一峰，姚锡虎， 等.三阴性乳腺癌临床病理特征及预后探讨[J].中外医学研究，2018，16（4）：163-164.

（收稿日期：2021-03-29） （本文编辑：姬思雨）