MTHFR C677T基因多态性与浙江地区汉族人群大动脉粥样硬化性脑梗死的相关性

邱玲玲 徐小辉 陈慧

[摘要] 目的 探讨MTHFR C677T基因多态性与浙江地区汉族人群大动脉粥样硬化性（LAA）脑梗死的相关性。 方法 选取2017年1月至2018年6月在我院住院患者及同期体检人员共360例，分为LAA脑梗死组（病例组）180例和对照组180例，应用PCR及TaqMan探针技术对MTHFR C677T进行基因分型检测，分析该基因多态性与LAA脑梗死的相关性。 结果 病例组和对照组间的SBP、FBG、HbA1c、TC、TG、叶酸、Hcy比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;两组间的年龄、DBP、LDL-C、HDL-C比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。两组间的基因型和等位基因频率分布比较，差异有统计学意义（P<0.05）。病例组TT型Hcy水平为[（14.10±3.96）μmol/L]高于CC型的[（9.81±3.04）μmol/L]及CT型的[（11.49±3.22）μmol/L]，对照组TT型Hcy水平为[（12.36±3.62）μmol/L]高于CC型的[（9.26±2.82）μmol/L]及CT型的[（10.15±3.04）μmol/L]。单因素線性回归分析显示，等位基因T与叶酸（r=0.261，β=-1.188，t=-4.847，P<0.001）、Hcy（r=0.317，β=2.404，t=6.327，P<0.001）、FBG（r=0.106，β=0.435，t=1.985，P=0.048）存在线性回归关系。Logistic回归分析示等位基因T、高血压、糖尿病、Hcy是LAA脑梗死的独立危险因素（P<0.05）。 结论 MTHFR C677T基因多态性影响Hcy、FBG，是浙江地区汉族人群LAA脑梗死的危险因素。

[关键词] 大动脉粥样硬化;基因多态性;同型半胱氨酸;亚甲基四氢叶酸还原酶

[Abstract] Objective To investigate the correlation between the gene polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase（MTHFR） C677T and large artery atherosclerosis（LAA） cerebral infarction in the population of Han ethnicity in Zhejiang Region. Methods From January 2017 to June 2018， a total of 360 inpatients and people receiving physical examination during the same period of time from Taizhou Municipal Hospital were selected. They were divided into 180 cases in LAA cerebral infarction group（case group） and 180 cases in control group. The PCR and TaqMan probe technology were applied for the genotyping of MTHFR C677T， and the correlation between this gene polymorphism and LAA cerebral infarction was analyzed. Results The differences in SBP， FBG， HbA1c， TC， TG， folic acid and Hcy between the case group and the control group were statistically significant（P<0.05）. There was no statistically significant difference in age， DBP， LDL-C and HDL-C between the two groups（P>0.05）. The difference in genotype and allele frequency distribution between the two groups was statistically significant（P<0.05）. The TT type Hcy level in the case group（[14.10±3.96] μmol/L） was higher than that of CC type（[9.81±3.04] μmol/L） and CT type（[11.49±3.22] μmol/L）. The TT type Hcy level（[12.36±3.62] μmol/L） in the control group was higher than that of CC type（[9.26±2.82] μmol/L） and CT type（[10.15±3.04] μmol/L）. Single factor linear regression analysis showed that allele T and folic acid（r=0.261， β= -1.188， t=-4.847， P<0.001）， Hcy（r=0.317， β=2.404， t=6.327， P<0.001）， and FBG（r=0.106， β=0.435， t=1.985， P=0.048） had a linear regression relationship. Logistic regression analysis showed that allele T， hypertension， diabetes and HHcy were independent risk factors for LAA cerebral infarction（P<0.05）. Conclusion MTHFR C677T gene polymorphism affects Hcy and FBG and is a risk factor for LAA cerebral infarction in the population of Han ethnicity in Zhejiang region.

[Key words] Large artery atherosclerosis; Gene polymorphism; Homocysteine; Methylenetetrahydrofolate reductase

大动脉粥样硬化性（Large-artery atherosclerosis，LAA）脑梗死是脑梗死的重要类型，具有高致残率、高病死率、高发病率等的特点。因此，加强对LAA脑梗死病因的研究有利于明确发病机制，减少发病率。有研究表明[1]，高同型半胱氨酸（Hyperhomocystinemia，HHcy）是LAA脑梗死的危险因素。同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）水平升高的原因主要包括环境及遗传两方面因素，其中遗传因素是影响Hcy代谢的重要方面。亚甲基四氢叶酸还原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是Hcy代谢过程中的关键酶，其主要作用为将5，10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸，后者是一种甲基供体，参与体内Hcy代谢过程而使Hcy浓度下降，当MTHFR上677位点的等位基因C突变为T时，编码的氨基酸发生变化使MTHFR活性及热稳定性下降最终导致Hcy水平升高[2]。MTHFR C677T突变后通过DNA甲基化影响Hcy水平[3]，促进动脉粥样硬化，加剧脑动脉狭窄程度[4]。因此，MTHFR C677T有可能是LAA脑梗死的候选基因。本研究拟探讨MTHFR C677T基因多态性与浙江地区汉族人群LAA脑梗死的相关性，为更好地指导LAA脑梗死的一级预防工作提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月至2018年6月在我院神经内科住院患者及同期体检人员共360例。LAA脑梗死180例（病例组），年龄40～78岁，平均（64.32±8.67）岁;其中男110例，女70例，均符合《中国各类主要脑血管病诊断要点2019》的LAA脑梗死诊断标准[5]。排除卒中史、颅内占位性病变、混合型脑梗死（梗死后出血或出血后梗死）者;排除动脉炎、寄生虫病、代谢障碍等其他原因所致的脑梗死者;排除患有严重心肝肾功能不全、血液病、呼吸衰竭、恶性肿瘤、免疫系统疾病、心脏瓣膜病、心房颤动者;排除妊娠者等。对照组为我院同期体检人员共180例，无急性缺血性脑卒中，经头颅MRI检查证实正常，年龄45～78岁，平均（62.67±8.17）岁;其中男97例，女83例。所有受试者近3个月内均未服用过叶酸、维生素B6、维生素B12。两组间的性别、年龄比较，差异无统计学意义（性别：χ2=1.921，P=0.201;年龄：t=1.864，P=0.063），具有可比性。本研究经台州市立医院医学伦理委员会批准，研究对象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 基本资料收集及相关诊断标准  所有受试者于入院时记录年龄、性别、收缩压（Systolic blood pressure，SBP）、舒张压（Diastolic blood pressure，DBP）、高血压病史、糖尿病史、卒中史、冠心病史及家族史等，入院第2天空腹抽取静脉血测定总胆固醇（Total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、三酰甘油（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、糖化血红蛋白（Glycosylated he-moglobin，HbA1c）、尿酸（Uric acid，UA）、空腹血糖（Fasting blood glucose，FBG）、Hcy、叶酸等指标。HHcy诊断标准：Hcy水平≥10 μmol/L[6];2型糖尿病[7]、高血压病[8]及血脂异常[9]诊断标准依据相关文献。冠心病包括有客观证据（如心电图、冠状动脉造影等）的心肌缺血、急性冠状动脉综合征（不稳定性心绞痛和急性心肌梗死）、陈旧性心肌梗死、稳定性心绞痛、冠状动脉旁路移植术（Coronary artery bypass grafting，CABG）及冠状动脉介入治疗术（Percutaneous coronary intervention，PCI）后患者[10]。

1.2.2 标本采集及DNA提取  受试者禁食12～14 h，取肘静脉血5 mL，加入EDTA抗凝试管中，严格按照MTHFR C677C/T基因检测试剂盒（深圳奥萨医药有限公司）说明书提取基因组DNA，并置于-20℃冰箱保存。同期取肘静脉血检测表1各代谢指标。

1.2.3 引物序列  参照文献[11]设计引物，上游引物为5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′，下游引物为5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′;由美國ABI公司合成。

1.2.4 基因多态性检测  采用PCR-TaqMan探针技术对MTHFR C677T基因（SNP ID：rs1801133）多态性进行检测，步骤如下：由美国ABI公司设计的两条MGB探针，一条以VIC 荧光标记碱基G，对应样本基因突变位点C;一条以 FAM 荧光标记碱基A，对应样本基因突变位点T。MTHFR C677T real-time PCR采用20 μL反应体系：10×PCR buffer 2 μL，25 mM MgCl2 1.12 L，rTaq 0.8 μL，100 mM dNTP 0.16 μL，引物探针 0.25 μL，DNA模板4 μL，dd H2O 11.67 μL。PCR扩增检测在 ABI 7500 实时荧光 PCR仪上进行。反应条件为：50℃2 min，95℃预变性 2 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共45个循环。产物扩增后同步进行数据分析，并使用Genotyping软件分析基因分型数据，各基因型结果见图1～3。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，计量资料符合正态分布、方差齐性时以（x±s）表示，采用t检验;计数资料以[n（%）]表示;采用χ2检验分析基因型及等位基因频率的分布差异;采用单因素方差分析比较各组内不同基因型间Hcy水平差异，两两比较采用LSD-t检验;采用单因素线性回归分析数量性状位点;采用Logistic回归分析影响LAA脑梗死的危险因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般临床资料比较

两组间的SBP、FBG、HbA1c、TC、TG、叶酸、Hcy比较，差异均有统计学意义（P<0.05），两组间的年龄、DBP、LDL-C、HDL-C比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 基因型和等位基因频率分布比较

两组人群基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，具有人群代表性。两组间的基因型和等位基因频率分布比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 两组内不同基因型间的Hcy水平比较

病例组和对照组内TT型Hcy水平分别高于本组CC型及CT型的Hcy水平，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.4 MTHFR C677T基因多态性与代谢指标的数量性状分析

以该基因位点作为自变量，将表1各指标（SBP、DBP、FBG、LDL-C、HDL-C、TC、TG、叶酸、Hcy）依次作为因变量，分别分析各指标与该基因多态性是否存在线性回归。等位基因T（TT型+CT型）与叶酸（r=0.261，β=-1.188，t=-4.847，P<0.001）、Hcy（r=0.317，β=2.404，t=6.327，P<0.001）、FBG（r=0.106，β=0.435，t=1.985，P=0.048）存在线性回归关系，差异有统计学意义（P<0.05），与其他代谢指标比较，差异无统计学意义（P>0.05），具体如下：等位基因T（TT型+CT型）与DBP（r=0.062，β=1.755，t=1.108，P=0.269）、SBP（r=0.012，β=0.558，t=0.224，P=0.823）、HDL-C（r=0.027，β=0.025，t=0.513，P=0.608）、LDL-C（r=0.063，β=0.025，t=1.193，P=0.234）、TG（r=0.003，β=-0.002，t=-0.049，P=0.961）、TC（r=0.007，β=0.003，t=0.132，P=0.895）。

2.5 多因素Logistic回归分析

以LAA脑梗死为因变量，以MTHFR C677T等位基因T及高血压、糖尿病、高三酰甘油血症、高胆固醇血症、Hcy作为自变量进行Logistic回归分析。MTHFR C677T等位基因T、高血压、糖尿病、Hcy为LAA脑梗死的独立危险因素，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

3 讨论

LAA脑梗死是多微效基因与多环境因素共同作用的复杂疾病。越来越多研究表明，危险因素与候选基因多态性的交互作用对复杂疾病的发生具有协同效应。因此，研究可能的候选基因（如MTHFR C677T），控制可控危险因素如Hcy，有利于早期识别LAA脑梗死的高危人群，明确危险分层，减少该疾病的发病率。

荟萃分析发现[12]，在欧亚人群的各种遗传模型中，该基因位点多态性均与LAA脑梗死有关，而上述相关性在非洲人群中差异无统计学意义。Cotlarciuc等[13]发现，在欧洲人群中MTHFR C677T基因多态性与LAA脑梗死有关。因此，目前有关MTHFR C677T基因多态性与LAA脑梗死的相关性尚无定论，可能与MTHFR C677T的突变率存在地域、种族差异有关。本研究结果显示，病例组突变率为51.67%，对照组为38.33%，符合文献报道中国人群的突变率范围[14-15]。两组间基因型和等位基因频率分布比较，差异有统计学意义（P<0.05），病例组TT基因型频率高于对照组（P<0.05），病例组T等位基因频率高于对照组（P<0.05）;Logistic回归分析显示，MTHFR C677T等位基因T是LAA脑梗死的独立危险因素[OR（95%CI）=1.676（1.033， 2.718），P=0.036]，提示携带T等位基因者患LAA脑梗死是非T等位基因者的1.676倍。以上说明MTHFR C677T基因多态性是浙江地区汉族人群LAA脑梗死的重要遗传危险因素。

本研究结果显示，病例组和对照组内TT型Hcy水平分别高于本组CC型及CT型的Hcy水平（P<0.05），且等位基因T与Hcy存在线性回归关系，MTHFR C677T等位基因T与Hcy呈正相关，与文献报道一致[14]。Logistic回归分析显示，HHcy是LAA脑梗死的独立危险因素（P<0.05），与Mao等[16]的结论一致。由以上可知，MTHFR C677T基因多態性可能通过影响Hcy代谢从而间接地影响LAA脑梗死的发生。另外，本研究结果显示，T等位基因与FBG存在线性回归关系，与FBG呈正相关，Logistic回归分析显示，糖尿病是LAA脑梗死的独立危险因素，提示MTHFR C677T多态性可能通过影响血糖间接影响LAA脑梗死发病。荟萃分析发现[2，17]，MTHFR C677T多态性与2型糖尿病有关，增加了2型糖尿病的遗传易感性，2型糖尿病是LAA脑梗死的重要危险因素[18]，上述文献与本研究结论一致。但该基因多态性影响血糖水平的确切机制未明，推测可能为：①2型糖尿病早期以胰岛素抵抗为主，后期以胰岛素分泌不足为主，MTHFR C677T与HHcy有关，Hcy影响胰岛β细胞的细胞活力，降低其胰岛素分泌功能，诱发胰岛素抵抗[2，19-20];②MTHFR C677T能影响DNA甲基化，而DNA低甲基化与高血糖有关[14]。结合以上可推知，MTHFR C677T基因多态性可能通过影响Hcy、血糖等LAA脑梗死的中间表型，导致代谢紊乱综合征，从而间接影响LAA脑梗死的发生。

综上所述，MTHFR C677T基因多态性与浙江地区汉族人群LAA脑梗死发病有关，从遗传学角度认为，等位基因T存在LAA脑梗死的遗传易感性，但因LAA脑梗死是多环境因素与多遗传因素共同作用的复杂疾病，MTHFR C677T等位基因T也可能通过与脑梗死的传统危险因素（如Hcy、糖尿病）的交互作用影响该疾病的发病风险，可能成为LAA脑梗死发病的预测因素。在今后的研究中，应在扩大样本量的基础上使用更精确的实验方法和统计方法进行多中心的病例对照研究，分析MTHFR C677T多态性与环境因素联合作用对LAA脑梗死发病的影响，以期有所突破，从遗传流行病学的角度为LAA脑梗死提供遗传学病因。

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（收稿日期：2019-03-20）