利用分子标记快速鉴定甜菜育性的研究

石好琪，丁刘慧子，邳 植，吴则东

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨150080）

0 引言

糖用甜菜(Beta vulgarisL.)属于苋科，甜菜属的一种二年生草本植物[1]，是除甘蔗以外的第二大糖料来源。甜菜利用杂种优势可以得到更加抗病高产的品种，但要想利用杂种优势，不育系和保持系的利用是不可缺少的。细胞质雄性不育(CMS)是甜菜杂交制种的主要方式。所有杂交甜菜品种的生产都依赖于单一的CMS来源。Owen[2]报道了甜菜雄性不育是由两个隐性核基因（x和z）与不育细胞质相互作用的结果。具有不育细胞质的甜菜只有在X和Z两个位点都携带显性等位基因时，才被假设为完全雄性可育。不育系利用保持系植株的花粉进行受精繁殖，甜菜保持系细胞核具有xxzz基因型和正常的可育细胞质。因为甜菜是无限花序作物，所以通过人工去雄的方式获得不育系是不可取的[3]。传统选育甜菜保持系的方法是利用鉴定法，它是利用已有的不育系与待鉴定的个体进行成对杂交，该方法的特点是鉴定效率高，比如程大友等[4]利用当年抽薹基因型甜菜选育甜菜保持系仅仅用了15个月左右就鉴定出来了甜菜保持系。尽管传统方法可以选育出合适的保持系和不育系，但还是耗时较长，并且还需要利用当年抽薹的甜菜，而且一旦某个环节出错就会导致选育失败。通过借助分子标记的手段可以快速鉴定细胞质和细胞核育性，从而快速确定甜菜是否为不育系或者保持系。鉴定细胞质类型是通过甜菜线粒体基因组中TR1串联重复序列的多态性[5]，保持系的TR1串联重复数为13，不育系的TR1串联重复数为4；鉴定细胞核的育性是通过不同核基因型甜菜DNA的bvORF17上游区的多态性[6]。刘一珺[7]在利用分子标记对甜菜育性进行鉴定时所用的甜菜DNA提取方法为CTAB法，但该方法提取效率较低，大规模提取时非常耗时。尽管王良[8]所采用的甜菜DNA提取方法为改良后的CTAB法，但同样存在步骤繁琐，效率低的缺点。裂解液法是一种新型的DNA提取方法，采用裂解液法进行甜菜DNA提取可以免去使用液氮和各种药品的麻烦，只需把米粒大小的嫩叶加入裂解液，而后用枪头进行简单捣磨，随后加热离心即可，这种DNA提取方法简单快捷，但所提取的DNA质量是否适用于甜菜育性鉴定却不知。双重PCR在甜菜[9]、玉米[10]、大豆[11]、水稻[12]等中均已用到。双重 PCR的利用可以加快相应的检测速度，但李士龙[13]、刘一珺[7]、刘巧红等[5]对甜菜育性进行鉴定时均采用普通PCR，这样就需要对同一份DNA进行两次鉴定，相对双重PCR更耗时。刘一珺[7]和王良[8]在对甜菜细胞质类型进行鉴定时采用1%琼脂糖凝胶电泳，但是聚丙烯酰胺凝胶电泳是否同样适合作为甜菜育性鉴定的电泳方式却不知。试验采用裂解液法作为一种新型DNA提取方式与CTAB法进行对比，以便找出更加适合甜菜DNA提取的方法；另外，通过采用双重PCR的方法对细胞质类型和细胞核育性进行鉴定，以探究双重PCR是否能扩增成功；最后，对比1%琼脂糖凝胶电泳和6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，以找出最佳电泳方式。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 试验材料为随机抽取的10份糖甜菜嫩叶和5份多胚种质资源叶片。

1.1.2 引物 试验所用引物包括鉴定细胞质育性的TR1引物[14]和鉴定细胞核育性的T1、T2引物[6]。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 试验试剂 裂解液、超光速Mix、荧光核酸染料、琼脂糖、1×TAE溶液、10×TBE溶液、TEMED、丙烯酰胺和N',N'-亚甲双丙烯酰胺混合液。

1.1.4 试验仪器 高速离心机、PCR仪、凝胶成像仪、金属浴锅。

1.2 试验方法

1.2.1 CTAB法和裂解液法提取DNA效果对比 CTAB法是一种较常用的用于提取甜菜DNA的方法[15]。裂解液法提取甜菜DNA是把甜菜嫩叶放入裂解液捣碎使基因组DNA释放出来，这种方法提取的DNA混杂程度较高，需要配合相应的Mix进行后续的操作。

1.2.2 双重PCR鉴定甜菜育性 甜菜细胞质和细胞核育性分别用一对引物进行鉴定，因此，要鉴定一株甜菜的育性就需要对同一DNA模板扩增2次然后判断其育性。采用双重PCR就可以把2对引物放入同一体系进行扩增，提高鉴定效率。因为鉴定细胞质基因型的引物扩增的条带大小为500 bp或750 bp，鉴定细胞核基因型育性的引物扩增的条带大小有1300 bp和18000 bp两种大小的带型，两者条带大小有一定差距不会影响结果判断。另外，两引物退火温度大小相同，所以双重PCR理论上是合适的，具体能否成功需要试验验证。

1.2.3 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳扩增效果对比 琼脂糖凝胶电泳在制胶速度、电泳时间以及分离范围上比聚丙烯酰胺凝胶电泳更具优势，而聚丙烯酰胺凝胶电泳有较高的分辨率，而且一次鉴定的样品较多。以往鉴定时均采用琼脂糖凝胶电泳，不确定聚丙烯酰胺凝胶电泳是否在甜菜育性鉴定时是否更具优势，因此试验采用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行扩增效果对比，以便在鉴定甜菜育性时选取合适的电泳方式。

1.2.4 PCR扩增 对甜菜细胞质鉴定用TR1引物，10 μL的PCR扩增体系含5 μL超光速Mix，0.2 μL的TR1引物，0.6 μL的T1、T2引物，1 μL基因组DNA，3.2 μL的纯净水。PCR扩增条件为95℃预变性3 min；94℃变性 25 s，60℃退火 25 s，72℃延伸 2 min，循环 27次；72℃延伸5 min，4℃保存。

1.2.5 电泳

（1）1%琼脂糖凝胶电泳

PCR扩增结束后，吸取5 μL产物进行点样，而后在130 V电压下电泳30 min。电泳后利用凝胶成像仪进行条带观察。

（2）6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

PCR扩增结束后，吸取2 μL产物进行点样，而后在180 V电压下电泳90 min。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，需要对胶进行染色，采用的方法是核酸染料20 μL+蒸馏水200 mL，充分混均，而后把胶放入其中轻轻摇匀，最后拿到凝胶成像仪进行条带观察。

2 结果与分析

2.1 CTAB法和裂解液法提取DNA结果对比分析

通过实验发现，裂解液法可以通过捣碎后液体的颜色来判断提取的DNA是否成功。捣碎后液体颜色为嫩绿色（如图1左）则DNA提取质量符合实验要求，若是颜色为褐色或棕褐色（如图1右）则提取失败，需要重新进行提取。

图1 裂解液法提取的甜菜DNA

试验中用CTAB法提取的甜菜DNA所用材料为随机抽取的多胚种质资源的叶片。用TR1引物扩增的部分结果如图2。从结果中可以看出，CTAB法和裂解液法提的DNA用引物均能有效扩增出来条带。而相较于CTAB法，裂解液法提取的DNA引物扩增效果相对更好，少数未出来结果为提取失败造成，结果如图3。

2.2 双重PCR鉴定细胞质类型和细胞核育性鉴定结果分析

随机选取10株甜菜DNA嫩叶，采用裂解液法进行DNA的提取，而后同时用TR1引物和T1、T2引物对DNA模板进行扩增，扩增结果如图4。从结果可以看出，除样品3没扩增出结果，其余扩增的条带均正常，且不影响同时判断2对引物所扩增的条带。

图4 甜菜细胞质类型及细胞核基因型鉴定的双重PCR扩增结果（裂解液法提取的DNA）

2.3 1%琼脂糖凝胶电泳和6%聚丙烯酰胺凝胶电泳扩增结果分析

采用同样的DNA提取方式以及PCR体系和程序，用琼脂糖凝胶电泳跑出来的条带效果是符合实验要求的，扩增结果如图2、3、4等。聚丙烯酰胺凝胶电泳采用的DNA模板和图4扩增所用的模板相同，扩增结果如图5。500 bp左右的条带完全扩增出来，并且与其他条带完全分离，符合实验要求，而1800 bp、1300 bp左右的条带却没有区分出来。整体来看，聚丙烯酰胺凝胶电泳扩增效果不理想，不适合作为甜菜育性鉴定的首选电泳方式。

图5 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳扩增结果（裂解液法提取的DNA）

3 讨论与结论

此次试验所采用的裂解液法提取DNA相对于刘一珺[7]、王良[8]所采用的CTAB法大大节省了提取时间，提取100份甜菜DNA只需要1 h，效率上远远优于CTAB法，为大规模用分子标记辅助进行甜菜育性鉴定奠定了基础。另外，本次试验所采用的双重PCR的成功，使得原本需对一份样品分别进行细胞质类型和细胞核基因型鉴定一次就能完成，这不仅较大节省了鉴定时间，还节约了一半的成本。通过对2种电泳方式进行对比得出，1%琼脂糖凝胶电泳相对于6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳具有更大的优势，因此刘巧红等[5]、刘一珺[7]、王良[8]所采用的1%琼脂糖凝胶电泳方式是合适的。

在DNA提取方法上，不同研究者也给出了很多优化策略。王茜等[16]采用碱裂解法提取虫草DNA，使提取一份的时间缩短到10 min以内，极大地简化了实验步骤，并且提取的DNA完全满足实验需求。刘乃新等[17]同样采用碱裂解法对甜菜干种子、幼苗、种仁以及叶片干粉等进行DNA的提取，提取的DNA在SSRPCR反应中均能扩增出清晰的条带，为快速鉴定甜菜品种纯度等提供了技术支持。郭景伦等[18]利用玉米单粒种子DNA快速提取新方法提取玉米种子DNA，一个人提取100粒种子只需30 min左右，大大节省了提取时间，提取的DNA完全适用于SSR-PCR反应。尽管前人在DNA提取中做出了很多优化，但所提取的DNA并不一定适用于实验要求。笔者结合刘乃新等[17]和王茜等[16]的碱裂解法，采用0.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的HCl对甜菜DNA进行提取，在用细胞质类型鉴定引物进行扩增时能扩增出理想的条带，但细胞核育性鉴定引物却扩增不出。因预计细胞核育性鉴定引物最大扩增条带为1800 bp左右，而细胞质类型鉴定引物扩增条带大小最大为750 bp左右，所以笔者做出如下推测，即对于较大条带的扩增，碱裂解法提取的DNA质量不符合实验要求。在整个甜菜育性鉴定体系中，1%琼脂糖凝胶电泳相对于6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳具有更大的优势。在试验中发现，聚丙烯酰胺凝胶电泳对于2000 bp左右大小的条带很难跑下来，这也是聚丙烯酰胺凝胶电泳相较于琼脂糖凝胶电泳弱势的地方之一。另外琼脂糖凝胶电泳制胶过程的便捷性也使其成为甜菜育性鉴定体系的首选电泳方式。分子标记辅助鉴定甜菜育性为甜菜育性鉴定带来了极大的便利，省去了大量的人力物力。

试验中所采用的裂解液法因在提取过程中没有对杂质进行去除，所以其DNA纯度很难保证。在对于DNA质量要求比较高的实验中，裂解液法所提取的DNA并不能保证适用。另外，因为所提DNA纯度较低，所以在进行PCR时，应适当增加程序的延伸时间以保证产物顺利被扩增出来。起初，在试验的PCR程序中，把循环数设置为35次，但扩增结果中出现严重的弥散现象，考虑是退火温度和循环数的问题。在经过梯度PCR对退火温度进行排除后，弥散现象仍未解决。在之后试验中对循环数进行调整，得出27个循环数是较为合适的，25个循环数会导致细胞核鉴定引物扩增出的结果较淡或者扩增不出结果。在甜菜育性鉴定的PCR扩增程序中，循环数是导致扩增条带有无的决定性因素，这在以往的实验中是被忽略的。

通过对10份糖甜菜和5份甜菜多胚种质资源嫩叶为试材，采用两种甜菜DNA提取方法、双重PCR以及两种电泳方式对甜菜育性进行鉴定，最终确定用裂解液法进行甜菜DNA的提取、双重PCR进行甜菜育性的鉴定、电泳方式选择用1%琼脂糖凝胶电泳可以达到快速鉴定甜菜育性的目的，为利用分子标记进行甜菜育性鉴定用于以后的育种工作奠定一定基础。