活血化瘀解毒法对OSF 患者GSK-3β、β-连环蛋白水平的影响及作用机制的研究

左巧娟，谭 劲，禹 洁，陈世娟，李 群，朱 萱

（湖南中医药大学1.第一附属医院口腔科；2.科技处，湖南 长沙410000）

口腔黏膜下纤维化（oral submucous fibrosis，OSF）属于一种渐变性和炎症性的黏膜纤维化慢性疾病，是世界卫生组织（World Health Organization，WHO）公认的口腔癌前病变［1-2］。口腔黏膜下纤维化患者的临床症状有口腔黏膜无斑块或纤维条索，扁平苔藓充血、糜烂、有刺激性疼痛，有明显的机械或化学因素刺激等。患者一旦出现进行性的张口受限的症状，其口腔内的唇、舌、口底、咽等部位均可能受到累及，严重者病症甚至会达到患者的咽部，造成严重的侵袭［3，4］。由此可见，此病可侵犯口腔的任何部位，入侵性较强。首次发现此病的地方是20 世纪50 年代初期的印度，但在尼泊尔、泰国、马来西亚、乌干达以及美国等也有相关病例的报道。我国湖南湘潭、台湾地区也是本病的高发地区。目前看，众多的西药只能改善和缓解OSF 症状，未能根治此病。近年来，中医药治疗OSF 取得了较好的疗效，本文选取2018 年5 月～2019 年12 月本院收治的120 例OSF 患者，研究活血化瘀解毒法对OSF 患者的治疗效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018 年5 月～2019 年12 月我院收治的120例OSF 患者，按照抽签法分为常规治疗组和活血化瘀解毒组，各60 例。常规治疗组男性34 例，女性26例，平均年龄（34.1±3.6）岁，平均病程（3.4±5.5）周；活血化瘀解毒组男性37 例，女性23 例，平均年龄（32.7±5.2）岁，平均病程（1.9±3.7）周；两组患者资料比较，无统计学差异（P＞0.05）。本次研究患者及其家属均知情，且均签署了知情同意书。

纳入标准：符合《口腔黏膜病学》中OSF 诊断标准；近1 个月未接受相关治疗；患者年龄18～65 岁。

排除标准：血液系统疾病；意识障碍、认知障碍患者；哺乳期或妊娠期；合并严重感染性疾病；资料不全患者。

1.2 方法

常规治疗组在其口腔黏膜病变区两侧将1 mL曲安奈德（昆明积大制药股份有限公司；生产批号：20160123；40 mg/mL）多次注射，每周两次持续治疗4 周。活血化瘀解毒组使用活血化瘀解毒法进行治疗，方药组成：当归15 g，红花10 g，赤芍10 g，丹参15 g，玄参15 g，生地黄15 g，白花蛇舌草10 g，金银花10 g。1 d 1 剂，分早晚温服，连续服药5 周。

1.3 观察指标

观察两组治疗前后的口腔黏膜病损面积、张口度、龈沟液及唾液中SFRP1 水平、中医症候评分、Wnt/β-catenin 信号通路蛋白表达量和临床疗效。

1.3.1 SFRP1 在龈沟液及唾液中的比较 使用ELISA 法检测龈沟液及唾液中SFRP1 的水平，使用美国Proteintech 公司生产的Human S-100B ELI⁃SAKit 试剂，所有检测操作根据说明书要求进行。实验操作步骤如下：将血清置于室温后，取出试剂盒，标记酶标板，制作标准品，以1∶2 的稀释液稀释样品；在反应孔上依次加入稀释好的待测血清及标准品100 μL/孔，放置37℃恒温孵育箱中湿育2 h；用专用洗涤液将反应板清洗3 次后，加入抗体工作液（1∶100 倍稀释后）100 μL /孔，置于37℃恒温孵育箱中湿育45 min；继续清洗反应板4 次后，在反应孔内加入TMB 溶液100 μL /孔，置于37℃恒温孵育箱中湿育45 min 后在将终止液加入反应孔，将反应孔放置酶标仪上测量吸光度并绘制曲线，参照去曲线上的数值相应得出样本中SFRP1 的值。

1.3.2 中医症候评分比较 根据《中药新药临床研究指导原则》记录口腔黏膜发白发硬、口腔黏膜刺激痛、纤维条索的症状，按其症状程度分别为一级、二级、三级分别计1、2、3 分，症状消失计0 分，并评价疗效。

1.3.3 两组治疗前后Wnt/β-catenin 信号通路蛋白表达量 Western blot 法检测GSK-3β、β-连环蛋白表达，并进行组间比较。抽取两组研究对象早晨空腹外周抗凝静脉血6 mL，用Hanks 液进行等倍稀释，严格根据操作要求分离提取中性粒细胞，将细胞数调整为1×107，采用Western blot 法提取中性粒细胞全蛋白，接着通过BCA 试剂盒实施蛋白浓度定量，泳道上样量均为20 μ g，然后电泳处理后转移到PVDF 膜，加入抗体和发光处理后利用凝胶显像仪进行显像，分析GSK-3β、β-连环蛋白条带灰度值，以GAPDH 作为内参蛋白。采用酶联免疫吸附法检测TGF-β1、IL-6 蛋白水平。

1.3.4 临床疗效比较 依据《中华口腔科学》对患者的治疗效果进行评价：（1）显效：开口度达到10 mm 以上，症状得到显著缓解或消失，症状积分减少≥80%；（2）有效：开口度在10 mm以内，症状在一定程度上缓解，症状积分减少在40%～80%；（3）无效：症状毫无缓解，甚至加重，症状积分减少＜40%。总有效率=（显效+有效）/总例数×100%。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 口腔黏膜病损面积及张口度的比较

两组治疗前口腔黏膜病损面积及张口度对比，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组治疗后张口度均大于治疗前，口腔黏膜病损面积小于治疗前（P＜0.05），且治疗后活血化瘀解毒组张口度大于常规治疗组，口腔黏膜病损面积小于常规治疗组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组口腔黏膜病损面积及张口度的比较（n=60，±s）Tab 1 Comparison of lesion area and mouth opening de⁃gree of oral mucosa（n=60，±s）

表1 两组口腔黏膜病损面积及张口度的比较（n=60，±s）Tab 1 Comparison of lesion area and mouth opening de⁃gree of oral mucosa（n=60，±s）

组别张口度（mm）治疗前治疗后口腔黏膜病损面积（cm2）治疗前治疗后常规治疗组30.17±4.82 35.47±6.72 8.79±2.17 7.85±1.42活血化瘀解毒组t P 29.72±4.83 0.511 0.610 39.82±7.67 3.304 0.001 8.84±2.14 0.127 0.899 5.49±1.27 9.596 0.000

2.2 SFRP1 在龈沟液及唾液中的水平比较

两组治疗前SFRP1 在龈沟液及唾液中的水平对比，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组治疗后SFRP1 在龈沟液及唾液中的水平均高于治疗前（P＜0.05），且治疗后活血化瘀解毒组患者SFRP1 在龈沟液及唾液中的水平高于常规治疗组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 中医症候评分比较

两组治疗前中医症候评分对比，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组治疗后中医症候评分均低于治疗前（P＜0.05），且治疗后活血化瘀解毒组中医症候口腔黏膜刺激痛、口腔黏膜发白发硬、纤维条索评分均低于常规治疗组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表2 两组SFRP1 在龈沟液及唾液中的水平比较（n=60，±s）Tab 2 Comparison of SFRP1 levels in gingival crevicular fluid and saliva（n=60，±s）

表2 两组SFRP1 在龈沟液及唾液中的水平比较（n=60，±s）Tab 2 Comparison of SFRP1 levels in gingival crevicular fluid and saliva（n=60，±s）

组别龈沟液唾液治疗后115.97±24.72 138.42±31.75 4.322 0.000常规治疗组活血化瘀解毒组t P治疗前89.04±24.35 88.45±24.17 0.133 0.894治疗前97.35±23.16 96.84±24.81 0.116 0.908治疗后127.48±30.27 141.74±31.93 2.511 0.013

表3 两组中医症候评分比较（n=60，±s）Tab 3 Comparison of TCM syndrome score（n=60，±s）

表3 两组中医症候评分比较（n=60，±s）Tab 3 Comparison of TCM syndrome score（n=60，±s）

组别口腔黏膜刺激痛治疗前9.48±2.17 9.40±2.21 0.201 0.842治疗后6.48±1.19 3.69±1.17 12.950 0.000口腔黏膜发白发硬治疗前7.39±1.97 7.48±1.86 0.257 0.797治疗后5.17±0.95 3.78±0.68 9.216 0.000常规治疗组活血化瘀解毒组t P纤维条索治疗前10.85±2.45 10.76±2.48 0.200 0.842治疗后7.52±1.59 4.67±1.38 10.490 0.000

2.4 两组治疗前后Wnt/β-catenin 信号通路蛋白表达比较

两组治疗前TGF-β1、IL-6、GSK-3β、β-连环蛋白表达对比，无统计学差异（P＞0.05）；两组治 疗 后TGF-β1、IL-6、GSK-3β、β-连 环 蛋 白 表达均低于治疗前（P＜0.05），且治疗后活血化瘀解 毒 组TGF-β1、IL-6、GSK-3β、β-连 环 蛋 白 表达低于常规治疗组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 两组治疗前后Wnt/β-catenin 信号通路蛋白表达比较（n=60，±s）Tab 4 Comparison of Wnt/β-catenin signaling pathway protein expression between the two groups before and after treatment（n=60，±s）

表4 两组治疗前后Wnt/β-catenin 信号通路蛋白表达比较（n=60，±s）Tab 4 Comparison of Wnt/β-catenin signaling pathway protein expression between the two groups before and after treatment（n=60，±s）

组别常规治疗组活血化瘀解毒组GSK-3β（g/L）治疗前3.59±0.78 3.51±0.74 0.576 0.565治疗后2.49±0.81 1.42±0.37 9.307 0.000 β-catenin（g/L）治疗前4.38±0.79 4.30±0.75 0.568 0.571治疗后2.34±0.84 1.12±0.27 10.710 0.000 TGF-β1（μg/L）治疗前25.94±6.49 25.79±6.58 0.126 0.902治疗后13.17±3.57 6.49±2.02 12.610 0.000 t P IL-6（pg/mL）治疗前26.89±6.48 26.84±6.42 0.483 0.966治疗后16.58±4.18 8.19±2.91 12.760 0.000

2.5 临床疗效比较

活血化瘀解毒组临床治疗总有效率高于常规治疗组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 两组临床疗效比较［n=60，n（%）］Tab 5 Comparison of clinical efficacy［n=60，n（%）］

3 讨论

OSF 是一种具有慢性、进行性、隐匿性等特征的口腔黏膜斑纹类疾病，且OSF 可进一步癌变，是国内外医学者们热点研究课题［5］。进食刺激性食物、嚼食槟榔、免疫、营养、遗传等是OSF 诱因。本病的高发人群为20～50 岁的青壮年，无明显性别差异［6］。但在不同的国家和地区中，男、女患者的比例又在一定程度上有所不同［7］。但也有研究显示，OSF 趋向男性化，可能与男性患者嚼食槟榔和抽烟喝酒等相关。我国男性患上口腔黏膜下纤维化的几率大于女性［8］。在中国的医学古籍中并没有OSF 的相关记载，但在《黄帝内经》中有与此病症状相似的疾病，根据其临床症状及表现，将其归纳为中医的“血瘀”、“积聚”等病证范畴。根据多年临床经验，淤是本病中医病机中的特点之一，治以活血养血、清热解毒为主，疗效显著［9］。

在中医学看来本病的患者因长时间食用辛辣燥热的食品，进而导致湿热毒邪入侵体内，蕴藏在人体脉络中，阻塞“三道（指谷道、气道、水道）”、“两路（指龙路、火路）”，导致局部经络气血运行不通畅，淤毒停驻在体内而发病，因此，治疗时采用活血养血、清热解毒的方法［10］。药方中当归的功效是：活血补血和止痛调经；红花的功效是：通经活血；赤芍的功效是：凉血活血和止痛散瘀；丹参的功效是：活血化瘀解毒、通经止痛；若将此四味药放在一起，则可以起到加强活血的功效和养血通脉的作用。生地黄的功效是：凉血和营、养阴生津；白花蛇舌草的功效是：清热解毒散淤、散结镇痛；金银花的功效是：清热解毒、清解血毒，其性轻、芬香透达 又 可 祛 邪 外 出［11，12］。在 临 症 治 疗 时，可 以 根据患者淤、毒的程度，酌情加适量的虫类药物起到破血行气、化痰散结、走窜通达的特性，或者加强行气止痛的功效，这样的话效果会更加理想［13-15］。在本文研究中，活血化瘀解毒法可有效地改善口腔黏膜病损面积、张口度、Wnt/β-catenin 信号通路蛋白表达量等各项指标，缓解患者口腔黏膜的疼痛感和受损面积，达到改善患者机体免疫功能状态，阻止纤维化的进程。治疗以外的时间可使用开口器、压舌板等加强张口训练，每天早中晚饭前各一次，每次5 min。

在多种纤维化的疾病中TGF-β1 对促进纤维化有着重要作用，而IL-6 是种多功能细胞因子可诱导淋巴细胞成熟，也可阻止机体炎症［16，17］。 Wnt/β -catenin 通 路 包 括GSK-3β、β -catenin 两个蛋白因子，在Wnt 通路中各司其职。在正常情况下，Wnt 通路是沉默的，小部分βcatenin 存于细胞质中，绝大部分在细胞膜处与E-cad 形成复合物，对细胞的黏附和迁移其作用［18］。当Wnt 通路被激活时，一系列的分子事件 则 会 导 致β-catenin 增 多［19］。β-catenin 进 入 细胞核与其他因子相结合形成核内复合物［20］。在本文研究中，治疗前两组患者的TGF-β1、IL-6、GSK-3β、β-catenin 表 达 均 较 高，此 时Wnt 通路活跃，但在使用活血化瘀解毒法治疗后TGFβ1、IL-6、GSK-3β、β-catenin 表 达 均 在 一 定 程 度上降低，中止了Wnt 通路的活跃，改善炎性因子水平，纤维蛋白原降低，张口度增加，患者口腔黏膜病损面积减小，效果显著。

综上所述，活血化瘀解毒法可通过作用于Wnt/β-catenin 信 号 通 路，调 控TGF-β1、IL-6、GSK-3β、β-连环蛋白的表达，改善口腔黏膜下纤维化患者临床症状，缓解机体炎症，减轻疼痛，效果显著。