亚甲蓝介导光动力抗菌化学治疗改善糖尿病下肢溃疡感染的初步临床研究

王久香，程庆丰，朱深银，陈欢欢，杜志鹏，唐紫薇

糖尿病下肢溃疡（diabetic lower extremity ulcer）是糖尿病患者一种常见的并发症，指下肢神经病变和不同程度的血管病变导致的下肢出现创面破溃、感染和/或深层组织破坏［1］。细菌感染是导致糖尿病下肢溃疡迁延不愈甚至截肢的最主要原因［2］。大多数糖尿病下肢溃疡感染为多种微生物引起的混合感染，包括需氧革兰阳性球菌、革兰阴性杆菌、真菌和厌氧菌［3］。目前糖尿病下肢溃疡感染通常在糖尿病基础治疗上实施系统性抗感染治疗，然而多数糖尿病下肢溃疡患者存在下肢动脉粥样硬化病变及灌注不足，全身用抗菌药物难以在下肢溃疡局部达到有效的治疗浓度，致使全身用抗菌药物果有限，且易出现多药耐药菌［4］。若感染未得到有效控制，溃疡创面可能会形成细菌生物膜，减少抗生素的渗透，进一步降低抗菌药物疗效，导致创面愈合迟缓［5］。因此，亟须开发一种具备新作用方式的抗菌治疗方法，以改善糖尿病下肢溃疡感染的治疗结局。

光动力抗菌化学治疗（photodynamic antimicrobial chemotherapy，PACT）为一种光辐照诱导局部微生物灭活的化学治疗方法［6］。PACT杀菌作用机制与传统的抗菌药作用不同，主要是通过特定波长的光照射，光敏剂吸收该波长的光能而处于激发状态，将能量传递给局部组织分子氧，作用后产生大量活性氧（单线态氧、超氧阴离子和氧自由基），作用于细菌细胞壁、细胞膜以及核酸等靶点，可杀灭抗生素敏感菌及耐药细菌，且不易产生细菌耐药。活性氧存在时间极短，局限在局部组织，利于局部治疗，不损伤周围组织［7］。有研究报道大部分光敏剂介导的PACT能对革兰阳性菌产生杀菌作用；而对于革兰阴性菌，只有阳离子光敏剂介导的PACT才能起到较好杀菌作用［8］。因此，阳离子光敏剂是广谱PACT所必需的。亚甲蓝（methylene blue，MB）作为阳离子光敏剂，很容易与革兰阴性菌脂多糖的负电荷结合，而革兰阳性菌胞质膜外只有荚膜物质和肽聚糖，因此，MB能轻易渗透通过革兰阴性菌和革兰阳性菌的细胞壁、细胞膜，可作为广谱杀菌光敏剂。ASPIROZ等［9］报道用1% MB介导红光照射能起到快速、广谱的杀菌效果，且无不良反应。然而目前通过光敏剂MB介导PACT作为一种辅助全身治疗方法改善糖尿病下肢溃疡感染的随机对照临床研究罕见报道。因此，本研究采用随机对照研究初步探究MB介导PACT对糖尿病下肢溃疡感染的疗效及安全性，以探索一种糖尿病下肢溃疡感染患者的新的、适宜性辅助治疗方法，为改善糖尿病下肢溃疡感染患者治疗结局提供依据和参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年3月—2020年2月在重庆医科大学附属第一医院内分泌科住院的糖尿病下肢溃疡感染患者为研究对象。糖尿病下肢溃疡感染的诊断依据为糖尿病患者下肢出现溃疡创面炎症表现［10］。糖尿病下肢溃疡严重程度根据Wagner分级系统进行分级［11］。糖尿病下肢溃疡创面按照国际糖尿病足工作组（IWGDF）和美国感染病学会（IDSA）的分级方法进行分级［3］（PEDIS分级）。纳入标准：（1）年龄18～80岁；（2）糖尿病病史在3个月以上；（3）治疗前1周内测定的溃疡创面标本细菌培养总细菌量＞104集落形成单位（CFU/ml），单个溃疡的最大直径＜10 cm、面积＜100 cm2；（4）下肢溃疡创面PEDIS分级2级或糖尿病足Wagner分级2级；（5）自愿参加本研究。排除标准：（1）出现严重脓毒症；（2）需要立即进行下肢血运重建，踝肱指数＜0.5；（3）孕妇或哺乳期女性；（4）对MB及其溶剂过敏；（5）有其他严重疾病如心脏病和肝肾功能不全等。退出标准：（1）在治疗过程中发生全身严重感染；（2）需要行下肢截肢；（3）出现其他严重的影响受试者健康和生命的疾病；（4）受试者撤除知情同意书。本研究所有受试者签署知情同意书，并经重庆医科大学附属第一医院伦理委员会批准（科研伦理批件2020-239）。

1.2 分组及治疗 根据计算机产生的随机数字表将研究对象分为试验组和对照组，各15例。所有患者根据相关诊疗指南进行常规的降糖、抗菌、调脂、改善血液循环等标准治疗。试验组治疗方法：溃疡创面外涂1%MB溶液，避光孵育30 min，光子治疗仪照射20 min〔普门公司，Carnation-11，波长（640±10）nm，总光能48 J/cm2〕，1次/d，连续治疗7 d。对照组治疗方法：在溃疡创面外涂0.9%氯化钠溶液，光照处理同试验组。

1.3 溃疡创面PEDIS分级及面积测量 患者分别于治疗前、治疗7 d后进行PEDIS分级；用数据照相机进行溃疡创面拍照，用Image J 软件3.0（National Institutes of Health）计算创面面积［12］。溃疡创面PEDIS分级与面积计算由设盲的非光动力治疗的研究者实施。

1.4 溃疡创面标本细菌负荷检测 将患者溃疡创面先用无菌0.9%氯化钠溶液冲洗，后将一根用0.9%氯化钠溶液浸湿的无菌拭子在溃疡创面表面擦拭，然后放入装有1 ml 0.9%氯化钠溶液的无菌试管中，倍数稀释后，将0.1 ml稀释后不同浓度的接种液均匀接种到血琼脂板上，进行标准细菌培养 24 h，根据平板上的菌落数计算溃疡创面细菌负荷（CFU/ml）［13］。

1.5 观察指标

1.5.1 人口学特征和临床特征 收集患者的人口学特征和临床特征，包括年龄、性别、体质指数（BMI）、糖尿病病程、糖化血红蛋白（HbA1c）、糖尿病周围神经病变发生情况、糖尿病血管病变发生情况、糖尿病肾病发生情况、糖尿病视网膜病变发生情况、溃疡部位、溃疡面积、溃疡病程、溃疡创面细菌类型、抗菌药物使用强度。

1.5.2 疗效指标 主要终点指标：溃疡创面细菌负荷（CFU/ml），分别于治疗前及治疗后即刻、治疗4 d后、治疗7 d后检测并记录。

次要终点指标：全身抗菌药物使用强度〔累计用药频度（DDDs）〕、溃疡创面PEDIS分级、溃疡面积（cm2）、血常规及C反应蛋白（C-reactive protein，CRP），于治疗前和治疗7 d后测定并记录。

1.5.3 治疗安全性观察 每天记录治疗过程中两组患者溃疡光照区域是否有红斑、水肿、水泡等不良反应及MB相关的全身过敏反应。

1.6 统计学方法 采用SPSS 24.0软件进行数据分析。采用K-S检验样本的正态性，计量资料中符合正态分布者以（±s）表示，两组比较采用两独立样本t检验；符合偏态分布者以M（P25，P75）表示，两组比较采用非参数检验；计数资料以相对数表示，两组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者人口学特征和临床特征及全身抗菌药物使用强度比较 两组患者年龄、性别、BMI、糖尿病病程、HbA1c、糖尿病周围神经病变发生率、糖尿病血管病变发生率、糖尿病肾病发生率、糖尿病视网膜病变发生率、溃疡部位、溃疡面积、溃疡病程、溃疡创面细菌类型、抗菌药物使用强度（累计DDDs）比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表1）。

表1 两组患者人口学特征和临床特征比较Table 1 Demographics and clinical characteristics in two groups

2.2 MB介导PACT对患者溃疡创面炎症及面积的影响 试验组患者在治疗1周后溃疡创面周围炎症红肿消退，溃疡创面脓性分泌物减少，溃疡床由黄期转为红期，而对照组溃疡创面炎症没有明显变化（见图1）。

图1 MB介导PACT对糖尿病下肢溃疡感染患者的治疗情况Figure 1 Effect of methylene blue-mediated photodynamic antimicrobial chemotherapy on diabetic lower extremity ulcer infection

治疗前两组患者溃疡创面PEDIS分级均为2级，治疗7 d后试验组溃疡创面PEDIS分级由2级转为1级9例（9/15），而对照组溃疡创面PEDIS分级无变化。两组患者治疗前、治疗7 d后溃疡面积（组间、组内）比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表2）。

表2 两组患者治疗前及治疗7 d后溃疡面积比较〔M（P25，P75），cm2〕Table 2 Wound area before and after 7-day treatment in two groups

2.3 MB介导PACT对患者血常规及CRP的影响 两组患者治疗前、治疗7 d后白细胞计数、中性粒细胞计数、中性粒细胞分数、血小板计数、血红蛋白比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组患者治疗前、治疗7 d后CRP比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；试验组患者治疗7 d后CRP低于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

表3 两组患者治疗前及治疗7 d后血常规及CRP比较Table 3 Routine blood test results and serum CRP before and after 7-day treatment in two groups

2.4 MB介导PACT对患者溃疡创面细菌负荷的影响两组患者治疗前和治疗后即刻溃疡创面细菌负荷比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；试验组患者治疗4、7 d后溃疡创面细菌负荷低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；试验组患者治疗后即刻和治疗4、7 d后溃疡创面细菌负荷低于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组患者治疗4、7 d后溃疡创面细菌负荷低于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05，见表4）。

表4 两组患者不同治疗时间溃疡创面细菌负荷比较（±s，CFU/ml）Table 4 Bacterial counts in the ulcer before and immediately，4 and 7 days after treatment in two groups

表4 两组患者不同治疗时间溃疡创面细菌负荷比较（±s，CFU/ml）Table 4 Bacterial counts in the ulcer before and immediately，4 and 7 days after treatment in two groups

注：两组数据为经lg转化后数据；与治疗前比较，aP＜0.05

组别 例数 治疗前 治疗后即刻 治疗4 d后 治疗7 d后对照组 15 6.5±1.3 6.2±1.3 5.1±1.4a 3.7±1.6a试验组 15 7.4±1.4 5.5±1.0a 3.1±1.0a 1.8±0.3a t值 -1.768 1.618 4.550 4.550 P值 0.088 0.117 ＜0.001 ＜0.001

2.5 MB介导PACT的不良反应发生情况 试验组和对照组患者在治疗过程中均未出现任何与光照和MB相关的辐照区域红斑、肿胀、疼痛、瘙痒等不良反应。

3 讨论

促进创面愈合是治疗糖尿病下肢溃疡感染亟须解决的问题，相关指南推荐糖尿病下肢溃疡感染治疗的原则是内科治疗结合外科治疗，其中内科治疗包括通过加强患者教育、个体化调整胰岛素或降糖药的用量严格控制血糖，改善血液循环，全身抗感染治疗；外科治疗包括清创、引流、减压等［14］。然而，糖尿病下肢溃疡感染因溃疡创面血流灌注不足、细菌耐药及生物膜形成给临床在糖尿病标准治疗基础上进行全身抗菌治疗带来了不少挑战，亟须探索一种新的局部辅助灭菌治疗方法以减轻创面感染，促进创面愈合。本研究利用已在临床使用的光敏剂MB介导PACT联合糖尿病下肢溃疡常规治疗，观察其对溃疡创面细菌负荷、炎症的影响，结果显示MB介导PACT可以改善糖尿病下肢溃疡感染，且具有良好的安全性。

PACT杀菌机制不同于抗菌药，主要通过光敏剂吸收光能产生大量活性氧（单线态氧、超氧阴离子和氧自由基）而灭活细菌，抗菌谱广，能够杀灭耐药菌，且不会产生细菌耐药。MB是临床常用生物染色剂和示踪剂，最大吸收波长为664 nm，可被光子治疗仪发射波长所激发，介导PACT。本研究结果显示，与治疗前相比，试验组治疗后即刻溃疡创面细菌负荷明显减少，表明MB介导PACT具有较强的快速杀菌效果。MORLEY等［15］报道光敏剂PPA904介导光动力治疗组治疗后即刻细菌负荷明显减少（P＜0.05），而对照组治疗前后细菌负荷没有明显差异。本研究进一步观察MB介导PACT治疗4、7 d后溃疡创面细菌负荷情况，结果显示试验组患者溃疡创面细菌负荷均明显低于对照组。MONAMI等［16］报道光敏剂RLP068介导光动力治疗2周后，50%患者的细菌负荷＜103CFU/ml，表明RLP068介导PDT在治疗2周后具有较好的杀菌效果。但是，本研究中试验组与对照组治疗7 d后溃疡创面细菌负荷明显降低〔（1.8±0.3）和（3.7±1.6）〕CFU/ml。光敏剂介导抗菌持续效应不同的原因可能与使用的光敏剂特性及辐照方案不同有关。两组患者在治疗过程中常规全身使用抗菌药物进行治疗，但两组间抗菌药物使用强度无差异；表明MB介导PACT治疗能明显降低糖尿病下肢溃疡感染患者溃疡创面细菌负荷。

溃疡感染创面的炎症及全身炎症相关指标主要由溃疡创面细菌负荷所决定。本研究中MB介导PACT治疗7 d后溃疡创面PEDIS分级降低（9/15），分泌物减少，溃疡床由黄期转为红期，显示MB介导PACT治疗通过直接杀灭细菌、降低创面细菌负荷、减轻溃疡创面炎症、促进创面新生肉芽组织生长而促进创面愈合。血常规及CRP为临床常用的反映全身炎症的指标［17］，本研究结果显示试验组治疗7 d后CRP明显降低，但对白细胞计数及中性粒细胞计数没有影响，可能与本研究纳入的受试者溃疡感染较轻，而CRP对炎症较血常规更敏感有关。本研究两组患者治疗后溃疡面积没有明显的差异，可能原因是治疗时间较短（只观察了7 d）而溃疡愈合需要一定时间；加之样本量较少，未能进一步评估更长时间MB介导PACT对糖尿病下肢溃疡愈合的改善效果。

以上结果显示MB介导PACT具有较好的杀菌、减轻炎症、促进创面愈合的作用，但本研究尚未对其机制进行研究，根据相关文献报道，其机制可能与以下几个方面有关：首先，MB介导PACT减少创面细菌负荷，不仅可减轻感染还可清除创面愈合的障碍，进而促进创面愈合［18］；其次，PACT可能通过免疫调节和促进生长因子的生成而促进创面愈合［19-20］。但目前尚无基础研究充分阐明相关机制，有待进一步深入研究。

综上所述，糖尿病下肢溃疡感染患者在常规标准治疗基础上进行MB介导PACT可有效杀灭溃疡创面细菌、降低溃疡创面细菌负荷、减轻溃疡局部炎性反应、促进肉芽组织生长，进而改善糖尿病下肢溃疡创面感染，且有良好的安全性，可为糖尿病下肢溃疡感染提供新的辅助治疗依据，有望成为糖尿病下肢溃疡感染治疗的一种有前景的方法。但还需要进一步大样本临床试验来验证其临床疗效及深入研究其作用机制。

本文链接：

光动力治疗（PDT）指通过特定波长的光照射，光敏剂吸收该波长的光能而处于激发状态，将能量传递给局部组织分子氧，作用后产生大量活性氧（单线态氧、超氧阴离子和氧自由基），进而诱导细胞凋亡的过程。PDT的三要素是光敏剂、特定波长的光、组织分子氧。PDT已广泛应用于癌症（包括皮肤癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、头颈癌）和非癌性疾病、类风湿关节炎（RA）、银屑病、寻常性痤疮等。光动力抗菌化学治疗（PACT）是一种光辐照诱导局部微生物灭活的化学治疗方法，也是一种不依赖于局部血供的非特异性抗菌疗法，不易产生耐药菌，不损伤周围组织，因此，PACT被认为是一种有前景的治疗慢性感染的方法。目前PACT广泛用于尖锐湿疣、口腔牙菌斑生物膜、痤疮丙酸杆菌、烧伤感染等。

本研究局限性：

（1）样本量较小；（2）观察时间有限，未观察到亚甲蓝（MB）介导PACT对溃疡创面的长期影响；（3）未对MB-PACT减轻溃疡创面炎症，促进溃疡创面愈合的机制进行研究。

作者贡献：王久香、朱深银负责文章的构思与设计、论文的撰写和修订；王久香、程庆丰负责研究的实施与可行性分析、结果分析与解释，对文章整体负责、监督管理；王久香、杜志鹏进行数据收集；王久香、陈欢欢进行数据整理；王久香、唐紫薇负责统计学处理；王久香负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。