山竹醇通过NF-κB信号通路抑制IL-1β诱导的髓核细胞炎症和细胞外基质降解

张顺利，顾运涛，陈 荣，赵 海

(海南医学院第二附属医院骨科一区，海南 海口 570102)

椎间盘退行性变(intervertebral disc degeneration，IDD)是一种常见的脊柱复杂疾病，会导致患者脊柱功能障碍和生活质量降低[1]。IDD常引起下腰痛，这是中老年群体中常见的症状，可造成巨大的社会负担[2]。正常的髓核可维持椎间盘的结构和功能，髓核衰老和功能受损是IDD发生的潜在原因[3]。有研究发现，在IDD过程中存在细胞外基质丢失、正常椎间盘髓核细胞表型改变、促炎细胞因子释放等现象，而干预髓核细胞的改变可以延缓椎间盘退变的进程[4-5]。有研究表明，多种炎性细胞因子的表达增加都与IDD的发生有关，白细胞介素(interleukin-1β，IL-1β)与肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-alpha,TNF-α)在IDD患者的髓核和纤维环细胞中表达均增加[6]。IL-1β与TNF-α可通过增加其他细胞因子的水平，诱导ADAMTS-4、ADAMTS-5和MMPs的表达，并抑制细胞外基质的合成[7-9]。有研究发现，山竹醇具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗炎、神经保护、抗菌等[10-14]。饲粮中添加山竹醇可通过改善仔猪的抗氧化能力，改变应激导致的脂质代谢紊乱，从而保护肝[13-14]。同时，山竹醇可通过抑制IL-1β诱导的软骨细胞炎症，发挥治疗骨关节炎的作用[10]。然而，山竹醇对椎间盘退行性变的治疗作用尚不明确。因此，本研究通过探讨山竹醇对IL-1β刺激的髓核细胞的保护作用，及对其炎症反应和相应基质代谢水平的作用，以期为临床治疗IDD提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

SD大鼠(2个月龄)购自中国科学院动物中心(上海)，山竹醇购自Sigma Aldrich公司，重组大鼠IL-1β购自Pepro Tech公司，一抗p-p65、p65、抗IκBα和抗β-actin抗体购自Abcam公司。所有动物实验均经海南医学院伦理委员会批准。

1.2 大鼠髓核细胞培养及处理

大鼠髓核细胞分离和培养的步骤参考文献[15]。SD大鼠用过量戊巴比妥钠安乐死，在无菌条件下收集L1～L5段腰椎间盘。解剖显微镜下从腰椎间盘中分离髓核组织，用0.25%胰蛋白酶及0.1% Ⅱ型胶原酶于37 ℃处理4 h，然后用含有1%青链霉素的DMEM/F12进行培养，每隔1 d更换1次完整的培养基。使用传代至第二代的髓核细胞进行后续实验。

1.3 MTT法检测髓核细胞活力

将大鼠髓核细胞接种于96孔板中，每孔8 000个。培养24 h后，根据细胞贴壁时间的不同，用含不同浓度(0、1、2.5、5、10 μM)山竹醇(溶于DMSO)联合或不联合IL-1β的新鲜培养基进行培养。向每个孔中加入10 μL MTT溶液，细胞培养箱中孵育4 h，使用酶标仪在OD 570 nm处测量每孔的吸光度值。

1.4 Western blot检测相关蛋白表达

用含不同浓度山竹醇(0、2.5、5 μM)联合或不联合IL-1β的新鲜培养基进行培养，分为Control组、IL-1β组、IL-1β+Gar 2.5 μM组和IL-1β+Gar 5 μM组，其中Control组用0 μM山竹醇不联合IL-1β处理髓核细胞，IL-1β组用0 μM山竹醇联合IL-1β处理髓核细胞，IL-1β+Gar 2.5 μM组用2.5 μM山竹醇联合IL-1β处理髓核细胞，IL-1β+Gar 5 μM组用5 μM山竹醇联合IL-1β处理髓核细胞，并用细胞裂解缓冲液收集。在冰上用细胞裂解液孵育30 min后，以12 000 r/min离心20 min，收集上清液，测量蛋白质浓度，配制蛋白上样标准品。蛋白质(40 μg)在10%～12% SDS-PAGE凝胶上分离，转载至PVDF膜上。将PVDF膜用封闭缓冲液孵育1 h，用p65(1∶1 000)、p-p65(1∶1 000)、IκBα(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)的一抗溶液孵育过夜，然后与相应的二抗孵育1 h。通过ECL-Western印迹试剂盒检测条带，并利用ChemiDicTM XRS成像系统对目标条带进行曝光，同时利用Image J图像分析软件进行统计。

1.5 定量RT-PCR检测靶基因mRNA表达

为了研究山竹醇是否能调节IL-1β刺激下的髓核细胞分解代谢水平，本研究检测了MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5 mRNA水平的表达。为了进一步研究山竹醇对髓核细胞基质代谢水平的影响，本研究检测了山竹醇对IL-1β刺激下的髓核细胞中细胞外基质蛋白(Col Ⅱ和Aggrecan)mRNA的表达水平的影响。用TRIzol法提取各组髓核细胞总RNA，用1 μg总RNA逆转录合成cDNA，用Prime-Script RT-PCR试剂盒和SYBR premix Ex Taq(Roche Diagnostics GmbH，Penzberg，Germany)预混料进行cDNA的合成和扩增。用DDCt法计算各靶基因mRNA水平，并将其标准化为内参基因(β-actin)的相对水平。具体引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6 免疫荧光染色检测观察p65核转移

P65染色时将髓核细胞接种于6孔板载玻片上24 h，每孔1×105/mL。用含不同浓度山竹醇(0、5 μM)联合或不联合IL-1β的新鲜培养基进行培养，分为Control组(0 μM山竹醇不联合IL-1β)、IL-1β组(0 μM山竹醇联合IL-1β)、以及IL-1β+Gar 5 μM组(5 μM山竹醇联合IL-1β)。细胞处理后用4%多聚甲醛固定细胞15 min，用0.1% Triton X-100孵育5 min，用10%牛血清白蛋白于37 ℃封闭1 h后，用抗p65(1∶500)的一抗孵育过夜，然后用相应的二抗孵育1 h。用DAPI染色7 min，在激光共聚焦显微镜下观察。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 山竹醇抑制髓核细胞凋亡

MTT法检测结果显示，山竹醇在0～10 μM剂量下对大鼠髓核细胞无细胞毒性；IL-1β可诱导髓核细胞活力降低(P<0.05)，剂量为2.5～10 μM的山竹醇能够改善IL-1β刺激下的髓核细胞活力(P<0.05)，见图1。因此，取山竹醇2.5、5 μM剂量用于实验。

a：一定浓度梯度的山竹醇对大鼠髓核细胞活力的影响；b：山竹醇对IL-1β刺激下髓核细胞活力的影响 *：与仅IL-1β刺激比较，P<0.05

2.2 山竹醇抑制IL-1β刺激的髓核细胞分解代谢活性

IL-1β刺激后髓核细胞中MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5 mRNA表达水平显著提高(P<0.05)，而山竹醇能抑制IL-1β刺激后的髓核细胞中MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5 mRNA表达水平(P<0.05)，见图2。

2.3 山竹醇改善IL-1β刺激后的细胞外基质水平

IL-1β下调了髓核细胞中Col Ⅱ和Aggrecan mRNA表达水平(P<0.05)，而山竹醇则显著改善了IL-1β刺激下髓核细胞中Col Ⅱ和Aggrecan mRNA表达水平(P<0.05)，见图3。

2.4 山竹醇抑制IL-1β刺激的髓核细胞中炎症因子水平增高

定量RT-PCR检测结果显示，IL-1β可显著提高髓核细胞中TNF-α、IL-6、IL-8、COX-2和iNOS mRNA表达水平(P<0.05)；而山竹醇可抑制IL-1β诱导的TNF-α、IL-6、IL-8、COX-2和iNOS mRNA表达水平(P<0.05)，见图4。

*：与IL-1β组比较，P<0.05

*：与IL-1β组比较，P<0.05

2.5 山竹醇抑制IL-1β刺激的髓核细胞中NF-κB信号通路

Western blot结果显示，IL-1β激活了髓核细胞中的NF-κB信号通路，而山竹醇逆转了IL-1β对NF-κB p65的活化作用(P<0.05)，同时逆转了IL-1β引起的IκBα蛋白水平降低(P<0.05)，见图5。免疫荧光染色结果显示，IL-1β刺激下髓核细胞核中发生p65核转移，山竹醇显著抑制了p65向核的转移(图6)。

*：与IL-1β组比较，P<0.05

*：与IL-1β组比较，P<0.05

图6 免疫荧光观察p65核转移(绿色：p65；蓝色：细胞核)

3 讨论

IDD发生在自然衰老过程中，是中老年人下腰痛最常见的原因，会造成巨大的社会经济负担[3]。已有研究表明炎症及细胞外基质降解与IDD的病理过程有关[5，16]。基质蛋白的丢失伴随着基质分解酶的上调，从而减弱了细胞外基质的吸水性，导致髓核水分含量减少和椎间盘压力下降[17]。MMPs(MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5)在IDD过程中的蛋白水解酶作用是导致主要细胞外基质蛋白Col Ⅱ和Aggrecan降解的主要因素。MMP-3、MMP-9和MMP-13是IDD过程中导致Col Ⅱ降解的关键酶，而ADAMTS-4和ADAMTS-5是导致Aggrecan降解的关键酶[18-20]。在IDD过程中，IL-1β和其他促炎因子上调，促炎因子的表达触发了蛋白水解酶的产生，从而破坏了椎间盘内细胞外基质的稳态[21]。有研究表明，IL-1β可上调椎间盘中MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5等分解代谢酶的表达[21-22]。本研究发现，IL-1β通过增加MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达来增强蛋白水解作用，而山竹醇则可使上述指标的表达下降；同时，山竹醇可上调IL-1β刺激后的髓核细胞主要细胞外基质蛋白(Col Ⅱ和Aggrecan)的基因表达。以上均表明，山竹醇可能在IL-1β刺激的髓核细胞中具有抗分解代谢作用，可保护基质蛋白免受降解。

有研究表明炎症与IDD的进展有关[23]。多种炎性细胞因子的表达增加与IDD变性的发生有关。在IDD过程中，促炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6刺激髓核细胞产生更多的炎症因子，导致细胞外基质降解酶升高，细胞外基质降解。促炎症因子，尤其是TNF-α和IL-1β，在IDD中起重要作用[24]。有研究表明，IL-1β能够上调细胞外基质降解酶，包括MMPs、ADAMTS，导致Ⅱ型胶原和蛋白多糖降解，最后髓核由于失去细胞外基质而严重降低保水能力，造成椎间盘内压力下降，功能受损[25]。在一项对猪的研究中发现，椎间盘内注射TNF-α可导致IDD[26]。而相关研究发现，山竹醇具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗炎、神经保护、抗菌[10-14]。饲粮添加山竹醇可通过提高仔猪的抗氧化能力，改善应激导致的脂质代谢情况，从而保护肝[13-14]。山竹醇可通过抑制小胶质细胞神经炎症因子的表达，治疗相关的神经病理性疼痛[11]。同时，山竹醇可通过抑制IL-1β诱导的软骨细胞炎症，治疗骨关节炎[10]。本研究结果显示，山竹醇可降低iNOS、COX-2、IL-6、IL-8和TNF-α表达水平，这提示山竹醇可抑制IDD过程中的炎症反应。

NF-κB是IDD进展过程中的关键分子。有研究发现，IL-1β可诱导NF-κB磷酸化[27-28]。NF-κB信号通路是IDD过程中一个重要的信号通路，具有诱导基质降解、促进炎症和抑制细胞外基质合成的能力[29]。NF-κB通常位于细胞质中，并与IκBα结合，IL-1β的刺激可释放NF-κB，并促进NF-κB从细胞质向细胞核转移，随后促进炎症因子(如MMPs、iNOS、COX2和IL-6等)的表达[30-31]。山竹醇可通过抑制NF-κB信号通路，从而抑制IL-1β诱导的软骨细胞炎症和骨关节炎[20]。本研究结果显示，山竹醇可通过抑制IκBα的降解，显著抑制IL-1β诱导的NF-κB激活，从而增加核内NF-κB的表达。这些结果表明，山竹醇能通过抑制NF-κB核移位和IkBα降解从而抑制IL-1β诱导的髓核细胞NF-κB活化。

综上，山竹醇可抑制IL-1β刺激下的髓核细胞炎症和细胞外基质降解，同时山竹醇可通过抑制NF-κB信号通路达到保护作用。因此，山竹醇对预防IDD有一定的作用，有望成为一种新的IDD治疗药物。