茶多酚对精索静脉曲张大鼠生精细胞凋亡的影响及机制研究

杜汉承,林文东,丁小明

(1.泉州医学高等专科学校解剖教研室，福建 泉州 362011；2.泉州医学高等专科学校基础医学部动物实验室，福建 泉州 362011)

精索静脉曲张(varicocele，Vc)表现为精索绒毛状丛的异常增大，是男性不育症的主要原因[1]。目前关于精索静脉曲张的机制尚不清楚，最新研究表明，支持细胞和生殖细胞之间的联系降低会导致生殖细胞凋亡，而波形蛋白为支持细胞提供保护和营养，因此在精索静脉曲张患者中波形蛋白表达降低会使细胞营养供给下降，进而引起生殖细胞凋亡[2]。细胞色素c(cytochrome c，Cyt-c)是氧化过程中的关键蛋白，Cyt-c的降低会引起线粒体功能异常，并诱导生精细胞过度凋亡[3]。茶多酚(tea polyphenol，TP)是一种强效抗氧化剂，可以防止许多细胞系和动物模型中的氧化应激及DNA损伤[4]。有研究显示，茶多酚可以缓解氧化应激引起的生殖细胞损伤[5]。但是茶多酚对精索静脉曲张的影响以及作用机制仍不清楚。本研究主要分析茶多酚对精索静脉曲张模型大鼠生精细胞凋亡及波形蛋白、Cyt-c蛋白表达的影响，并分析其作用机制，为临床治疗精索静脉曲张提供新的参考方案。

1 材料与方法

1.1 主要材料

清洁级SD大鼠(合格证号：2015000553055)，雄性，6周龄，由上海斯莱克实验动物中心提供，无菌饲养于泉州医学高等专科学校的SPF级屏障系统动物实验室内[许可证号：SYXK(闽)2016-0001]，保持温度23～25 ℃、相对湿度25%左右。

茶多酚(Selleck公司，中国)，TUNEL染色试剂盒(碧云天公司，中国)，显微镜(Olympus公司，日本)，氧化应激试剂盒(三工生物技术有限公司，中国)，组织匀浆机(Thermo Fisher Scientific公司，美国)，TRIzol(Sigma公司，美国)，Prime Script-RT和SYBR Premix Ex Taq试剂盒(Takara公司，日本)，RIPA裂解缓冲液(Beyotime公司，中国)，BCA试剂盒(武汉博斯特生物技术有限公司，中国)，抗体(Abcam公司，美国)，PVDF膜(Bio-Rad公司，美国)。

1.2 动物分组、建模和干预

将36只SD大鼠随机分为对照组、Vc组和Vc+TP组，每组12只。Vc组和Vc+TP组通过左肾静脉结扎构建精索静脉曲张模型[6]，具体方法如下：大鼠腹腔注射5%水合氯醛进行麻醉，切开腹直肌暴露左侧肾，部分结扎左侧肾静脉，使肾静脉内径狭窄。对照组仅切开腹腔暴露左侧肾静脉但不结扎。Vc+TP组采用茶多酚灌胃，剂量为40 mg/kg[7]，每日1次，持续4周；对照组和Vc组以等量生理盐水灌胃，持续4周。

1.3 HE染色观察睾丸组织损伤

干预后，所有大鼠腹腔注射2%戊巴比妥，断头处死后取出睾丸组织；用4%多聚甲醛固定，再用梯度乙醇脱水；经石蜡包埋，制成厚度为4 μm的切片并制作玻片标本；加入苏木精室温孵育10 min，然后加入0.5%曙红溶液室温孵育3 min，显微镜下观察。

1.4 TUNEL染色检测细胞凋亡

取按照1.3方法制作的睾丸组织玻片标本，根据TUNEL试剂盒说明书加入TUNEL反应液试剂与底物二氨基联苯胺进行反应染色，然后在显微镜的高倍镜下随机观察5个视野，计算凋亡指数，凋亡指数=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.5 氧化应激指标检测

将睾丸组织制作成组织匀浆，以3 000 r/min的速度离心25 min，根据氧化应激试剂盒检测丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平。

1.6 RT-qPCR检测mRNA表达

使用TRIzol提取睾丸组织中总RNA，用逆转录cDNA试剂盒逆转录1 μg RNA用于合成cDNA(42 ℃下60 min，70 ℃下5 min，4 ℃保存)。使用SYBR Green PCR Master Mix和PCR检测系统进行RT-qPCR实验(95 ℃下10 s，50 ℃下30 s，72 ℃下30 s，40个循环，4 ℃保存)。将GAPDH作为内参，通过比较循环阈值大小分析mRNA的表达水平。

1.7 Western blot检测蛋白表达

将所有的睾丸组织用匀浆机均匀研磨后萃取总蛋白，通过BCA试剂盒测量浓度。各组分别取40 μg总蛋白，用10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳(80～120 V，90 min)，在100 mV恒定电压下与PVDF膜进行湿转移，在5%牛血清白蛋白中室温孵育1 h。将1∶500稀释的anti-CaSR、anti-PI3K和anti-AKT添加到分离的蛋白中，4 ℃孵育过夜。洗涤后在室温下添加二抗孵育1 h，然后加入化学发光试剂进行显影。利用GAPDH作内参，用Image J软件分析目标条带的灰度值。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 茶多酚对精索静脉曲张大鼠睾丸组织的影响

睾丸组织切片HE染色结果显示，对照组生精小管内的生精细胞排列有序，管腔中有精子；Vc组出现广泛的上皮损伤，液腔，生精细胞无序分布，睾丸生精功能明显受损；Vc+TP组损伤情况明显轻于Vc组，生精细胞排列基本有序，管腔中有少量精子(图1)。

2.2 茶多酚对精索静脉曲张大鼠生精细胞凋亡的影响

3组间凋亡指数比较，差异有统计学意义(P<0.05)。对照组有少量的TUNEL阳性生精细胞，凋亡指数为(5.21±0.86)%；Vc组可广泛观察到TUNEL阳性生精细胞，凋亡指数为(21.09±1.82)%，显著高于对照组(P<0.05)；Vc+TP组TUNEL阳性生精细胞较Vc组少，凋亡指数为(12.36±1.05)%，显著低于Vc组(P<0.05)，见图1。

黑色箭头：损伤上皮；红色箭头：阳性生精细胞，表示细胞凋亡

2.3 茶多酚对精索静脉曲张大鼠氧化应激水平的影响

3组间MDA和SOD水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。Vc组MDA水平显著高于对照组(P<0.05)，SOD水平显著低于对照组(P<0.05)；Vc+TP组MDA水平显著低于Vc组(P<0.05)，SOD水平显著高于Vc组(P<0.05),见表1。

表1 茶多酚对精索静脉曲张大鼠氧化应激指标的影响

2.4 茶多酚对精索静脉曲张大鼠波形蛋白、Cyt-c mRNA的影响

3组间波形蛋白、Cyt-c mRNA水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。Vc组波形蛋白mRNA显著低于对照组及Vc+TP组(P<0.05)，而Cyt-c mRNA显著高于对照组及Vc+TP组(P<0.05)，见表2。

表2 茶多酚对精索静脉曲张大鼠波形蛋白、Cyt-c mRNA的影响

2.5 茶多酚对精索静脉曲张大鼠波形蛋白、Cyt-c蛋白表达的影响

3组间波形蛋白、Cyt-c蛋白表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。Vc组波形蛋白表达水平显著低于对照组及Vc+TP组(P<0.05)，而Cyt-c蛋白表达水平显著高于对照组及Vc+TP组(P<0.05)，见图2、表3。

图2 大鼠睾丸组织Western blot检测结果

表3 茶多酚对精索静脉曲张大鼠波形蛋白、Cyt-c蛋白的影响

3 讨论

健康男性人群中精索静脉曲张的发生率为15%～20%，且35%～50%的原发性不育男性和80%的继发性不育男性皆患有精索静脉曲张[8]。静脉曲张切除术是治疗精索静脉曲张引起的男性不育的最常用技术，然而其手术效果有限。有研究显示，经静脉切除术治疗的精索静脉曲张患者精液相关指标仅改善了50%～80%，表明精索静脉曲张切除术不能完全恢复患者生育能力[9]。

精索静脉曲张主要是由精索静脉瓣功能异常、静脉血管损伤等引起的静脉回流损伤，其通过引起组织灌注异常，导致含氧量降低和氧化应激反应，进而引起支持细胞和生精细胞损伤，其中氧化应激反应是导致精索静脉曲张和生精细胞损伤的关键机制。研究显示，茶多酚作为一种有效的抗氧化剂，可以缓解心肌缺血引起的心功能受损[10]；在脑缺血大鼠中，氧化应激是引起炎症反应、诱导海马神经元凋亡的主要原因，而茶多酚可以通过减少氧化应激损伤保护血脑屏障功能，从而缓解神经元凋亡[11]。也有研究显示，茶多酚对生殖细胞损伤的修复有一定作用，其可以减少由铝引起的睾丸中支持细胞的损伤和凋亡，从而保护睾丸的功能[12]，还可以通过缓解氧化应激反应提高精液中精子浓度，改善精子活力和形态，从而提高精子质量[13]。但是茶多酚对精索静脉曲张的影响尚不明确，本研究通过部分结扎左侧肾静脉构建大鼠精索静脉曲张模型，并经茶多酚灌胃治疗，结果显示茶多酚可以明显缓解氧化应激损伤，抑制生精细胞和支持细胞的凋亡，从而缓解精索静脉曲张。

为进一步分析茶多酚治疗精索静脉曲张的机制，本研究检测了波形蛋白mRNA和蛋白、Cyt-c mRNA和蛋白的表达水平。Cyt-c主要存在于线粒体中，而线粒体是有氧呼吸的主要场所，灌注不足、氧气含量降低和活性氧自由基升高会直接引起线粒体功能受损、线粒体外膜通透性改变，进而引起Cyt-c的外流[14]。线粒体损伤不但会加剧氧化应激反应，也会直接导致线粒体途径的凋亡，从而诱导生精细胞和支持细胞凋亡[15]。有研究显示，减轻线粒体损伤可以缓解精索静脉曲张引起的生精细胞凋亡[16]。波形蛋白是重要的支持蛋白，在维持睾丸中支持细胞的功能和形态上发挥关键作用，并且波形蛋白也具有连接支持细胞和生精细胞的作用[17]。氧化应激反应会降低波形蛋白的表达[18]，而波形蛋白表达的降低会减少支持细胞和生精细胞的连接，抑制支持细胞的增殖，从而诱导生精细胞凋亡[19]。本研究结果显示，精索静脉曲张大鼠睾丸中Cyt-c水平升高而波形蛋白水平明显降低，茶多酚干预后Cyt-c水平降低而波形蛋白水平升高，提示茶多酚可能通过提高波形蛋白的表达恢复细胞正常形态和功能，并减少细胞的凋亡。还有研究显示，茶多酚可以保护线粒体功能，抑制Cyt-c水平，从而减轻胰腺的氧化应激损伤[20]。张玉森等[21]的研究显示，茶多酚可以通过保护线粒体功能缓解阿尔茨海默症大鼠的神经损伤。这提示茶多酚可以通过抑制活性氧调控氧化应激水平，从而保护线粒体功能、抑制Cyt-c的外流及细胞凋亡；此外，茶多酚也可以促进波形蛋白的表达，从而增加支持细胞与生精细胞之间的连接，保护生精细胞的功能，促进精子生成，缓解精索静脉曲张。

综上所述，茶多酚可通过抑制氧化应激反应，保护线粒体功能并促进波形蛋白表达，从而抑制生精细胞的凋亡和睾丸损伤，发挥缓解精索静脉曲张的作用。但是关于茶多酚对精索静脉曲张的疗效仍需临床试验验证，其调控的分子机制值得进一步深入研究。