一种内源性复合微生物菌剂的特性及其固定化对猪场粪污水的处理效果

尤新新，王晟，都林娜

（温州科技职业学院，浙江 温州325006）

养殖场畜禽废弃物（主要包括畜禽在养殖过程中排放的污水、粪渣），已成为农村和农业面临的主要环境问题[1]。我国是养猪大国，随着养猪业的发展，生猪饲养模式逐渐转型为集约化养殖，在该养殖模式下，大量集中的粪便污水排放所引起的环境污染问题也越来越严重[2]。面对高有机质、高氨氮含量的猪场污水，国内现今处理方式的理论体系和经验积累依然不足，处理设施和流程设计也不成熟，致使国内大多数养猪场污水没有得到有效处理。

在众多已报道的猪场粪污水处理方法中，利用复合微生物制剂进行污水净化处理，是一个很有发展前景的领域，也是目前的研究热点[3-4]。复合微生物制剂是微生态制剂的一种，是由多种菌按合适比例复合配制而成的，以充分发挥微生物群落成员之间的协同作用，从而获得最佳应用效果[4]。

微生物原位修复技术是指在基本不破坏土体和水体自然环境条件下，对受污染对象不作搬运，而在原场利用土著微生物的功能，对污染物进行吸收、转化或降解，从而实现减缓或最终消除污染的技术[5]。该修复技术是一种从根本上解决环境污染问题的经济、健康的发展方法[6]。我国目前主要侧重于研究复合菌剂的应用效果[7-8]，但由于菌剂的地域适应性较弱，稳定性不够，群体结构易受到环境影响，从而导致菌剂的群体优势被改变[9]。同时，由于猪场污水的流动性及周围不利的环境条件易造成菌体在流态水体中缺少载体、易流失、菌体密度降低等问题，使得微生物净化作用受到限制[10]。而固定化微生物技术可降低功能微生物受外界不利因素的影响程度，微生物活性强、密度高，且可缩短反应时间和实现微生物快速高效分离，具有良好的应用前景[11]。小麦麸皮作为小麦生产过程中的副产物，来源广泛，价格低廉，但由于麸皮的口感粗糙、难以使用等问题，使得麸皮的综合利用率不高[12]。而小麦麸皮还具有高持水性、持油性及吸附性等特点，麸皮等生物基质可以与微生物相互吸附，保护并提高微生物活性[13]。

基于猪场粪污水污染问题及目前处理措施效果不佳等现状，本研究以规模化猪场粪污水为研究对象，利用微生物原位修复技术，以污水原液为主要营养来源，通过富集培养内源性土著微生物得到内源性复合微生物菌剂，并分析监测在污水处理过程中其对化学需氧量（chemical oxygen demand,COD）和氨氮的削减效果，从而筛选出高效去除猪场粪污水的复合微生物菌剂；进一步通过高通量测序，明确该菌剂的主要微生物种类并预测其功能结构。此外，本研究还比较了高效复合微生物菌剂和经小麦麸皮固定化处理的复合微生物菌剂的除污效果，旨在为全国畜禽养殖污水科学合理排放提供科学依据，也为养殖企业对粪污综合治理技术的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

猪场粪污水样分别采自浙江省温州市鹿城区规模养殖场（温州市展宏畜牧有限公司）（标记为ZW）及浙江省温州市农业科学研究院科技园实验猪场（标记为ZR）。将采集到的粪污水样装至采样瓶内，送至实验室后于室温下保存，待测。

1.2 实验方法

1.2.1 复合微生物菌剂的富集制备

将猪场粪污水置于5 ℃低温培养箱中，以150 r/min 振荡培养5 d，再将振荡后的粪污水与原液以体积比1∶10的比例混合，继续置于相同环境中进行振荡培养（以原液作为主要的营养来源），重复上述步骤，共传代5 次；然后，将振荡培养后的粪污水与原液粪污水以体积比1∶10的比例混合，并置于25 ℃常温培养箱中，以150 r/min振荡培养3 d，重复上述步骤，共传代4次，富集培养得到内源性复合微生物菌剂（标记为WKM）。将最终获得的富集物（含10%甘油）置于-40 ℃冰箱中保存，用于后续实验。

1.2.2 复合微生物菌剂的固定化

小麦麸皮经超微粉碎机处理后制成细麸皮，将细麸皮和复合微生物菌剂（WKM）分别以质量体积比为0.5∶50、1∶50、2∶50、3∶50、4∶50 和5∶50 进行混合，然后分别置于25 ℃恒温培养箱中，以150 r/min振荡培养3 d，使细麸皮和菌剂充分混合均匀，最后通过静置或离心分离其中的固体成分（包含微生物和麸皮），制得固定化复合微生物菌剂。同时，将无添加（CK）、只添加麸皮、只添加WKM作为对照组，并重复上述固定化处理步骤。

1.2.3 固定化复合微生物菌剂的部分除污特性测定

将麸皮固定化复合微生物菌剂按质量体积比为1∶200 的比例投加到猪场粪污水中，并置于通气条件下孵育，定时取样，测定COD和氨氮水质指标。其中：COD 含量的测定采用重铬酸钾法；氨氮含量的测定采用纳氏试剂比色法。

1.2.4 数据分析

将复合微生物菌剂送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行高通量测序，并采用Excel 2010和Origin 9.0对数据进行整理和作图，采用SPSS 23.0中的t检验和单因素方差分析对数据进行差异显著性检验，并采用GraPhlAn、PICRUSt 和R 软件对微生物群落结构进行分类及功能预测分析。

2 结果与分析

2.1 复合微生物菌剂的富集及除污特征

按照1.2.1节的方法对猪场粪污水（ZW）中的微生物在常温下传代4 次，富集培养得到复合微生物菌剂（WKM）。结果发现，在原液COD 质量浓度为8 757 mg/L、氨氮质量浓度为462.13 mg/L的猪场粪污水（ZW）中加入WKM 处理3 d 后，该复合微生物菌剂对猪场粪污水中COD 和氨氮去除率分别达94.8%和61.8%。

由于菌体在流态水体中易流失，造成除污效果不稳定。因此，本研究对WKM 进行麸皮固定化处理，并将麸皮固定化复合微生物菌剂（质量体积为1∶50）、WKM、麸皮分别以质量体积比为1∶200的比例分别投加到浙江省温州市农业科学研究院科技园实验猪场粪污水（ZR）中，原污水的COD 质量浓度为2 242 mg/L，各处理去除效果如图1 所示。与无添加（CK）组相比，只添加WKM 对污水ZR 中COD 的去除效果有明显的提高，与投加到污水ZW中的去除效果一致；经麸皮固定化后的复合微生物菌剂对COD 的去除率进一步提高，高达89.4%，极显著高于无添加组（P＜0.01）和显著高于WKM 组（P＜0.05）。说明经过麸皮固定化的复合微生物菌剂，其功能微生物受外界因素冲击影响较低且活性强、密度高，因此，在污染水体中COD的处理效果相较于WKM 更加稳定和高效。此外，经麸皮固定化后的复合微生物菌剂对氨氮的去除率为32.5%，与无添加组和WKM组相比，去除率稍有下降。

2.2 复合微生物菌剂的菌种类型及丰度

分别对复合微生物菌剂的3 个平行样（WKM-1、WKM-2、WKM-3）的16S rRNA 基因进行高通量测序，以明确其中的微生物种类及群落结构。图2为用GraPhlAn 软件绘制的3 个平行样的微生物分类和系统发育信息可视化图。根据样本的分类学比对结果可知，复合微生物菌剂的优势微生物主要分布在变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）中。

图1 固定化复合微生物菌剂对猪场粪污水中COD 和氨氮的去除效果Fig.1 Removal efficiencies of COD and ammonia nitrogen in wastewater from pig feedlots treated by the endogenous compound microbial inoculant immobilized with wheat bran

由图3 可知，在16S rRNA 基因数据库中，在属水平上，除未分类（unclassified）的序列（36.47%）和其他（other）序列（23.86%）外，检测到的16S rRNA基因序列主要对应的微生物种类属于白色杆菌属（Leucobacter）（4.59%）、卡 斯 特 兰 尼 菌 属（Castellaniella）（4.58%）、Camelimonas 属（4.08%）、Moheibacter 属（4.14%）、亚 硝 化 单 胞 菌 属（Nitrosomonas）（3.01%）、Cloacibacillus 属（3.02%）和尼古丁降解菌属（Pusillimonas）（2.17%），丰度比例约为2∶2∶2∶2∶1.5∶1.5∶1。

基于16S rRNA基因测序获得的物种构成，利用PICRUSt 软件推测样本中的功能基因，从而观测样品在更高层级水平上的功能结构，其中基于直系同源蛋白簇（clusters of orthologous groups of proteins,COG）的功能分布结果如图4 所示。在预测的样品微生物功能结构中，氨基酸转运和代谢（[E]）、能量产生与转化（[C]）、碳水化合物转运和代谢（[G]）、无机离子转运和代谢（[P]）、辅酶转运和代谢（[H]）的功能丰度相对较高。

2.3 固定化复合微生物菌剂对猪场粪污水处理的优化效果

为分析细麸皮与WKM按不同比例固定后对猪场粪污水中COD和氨氮去除率的影响，分别以质量体积比为0.5∶50、1∶50、2∶50、3∶50、4∶50 和5∶50 的比例将细麸皮和WKM进行混合，使其相互吸附，并比较其对猪场粪污水（ZR）的处理效果。从图5 可以看出：质量体积比为1∶50的麸皮固定化复合微生物菌剂对COD的去除率高达89.4%，显著优于质量体积比为0.5∶50（COD 的去除率为59.0%）和3∶50（COD的去除率为68.3%）的固定化复合微生物菌剂的去除效果（P＜0.05）。而质量体积比为1∶50的麸皮固定化复合微生物菌剂对氨氮的去除率为32.5%，与质量体积比为0.5∶50（氨氮的去除率为53.7%）和3∶50（氨氮的去除率为53.4%）的麸皮固定化复合微生物菌剂相比，有明显的下降（P＜0.05）。

3 讨论与结论

复合微生物菌剂自20 世纪70 年代出现至今，已被广泛应用于水环境污染治理等环保领域[14-15]。但由于复合微生物菌剂的地域适应性较弱，群体结构易受到水体流动性的影响，因而其净化效果也受到限制。本研究利用原位修复技术，通过富集猪场粪污水内源性微生物制备复合微生物菌剂（WKM），利用土著微生物的性能，同时通过麸皮固定复合微生物菌剂，稳定了微生物密度，提高了微生物活性，极大地强化了其生物处理效果，特别是对COD的去除效果显著提高，极显著高于无添加组（P＜0.01）。固定化配比优化实验结果表明，按质量体积比1∶50的比例混合麸皮和WKM后，COD去除效果最佳，达到89.4%。高云超等[16]对城市污水处理厂和猪场污水处理站的微生物区系进行筛选并用制备的复合微生物制剂（CMP）曝气处理猪场污水3 d 后，该复合微生物制剂对猪场污水中COD 的去除率为53.0%～66.7%。杨小龙等[17]从鱼塘淤泥和猪场废水混合液中分离筛选出复合微生物菌剂，并将其投加到富营养化污水中处理72 h后，该复合微生物菌剂对富营养化污水中COD 的去除率达81.36%。对比目前已报道的复合微生物菌剂，本实验富集培养的复合微生物菌剂（WKM）对污水中COD 的去除效果较好。但不同质量体积比的麸皮和WKM 混合对猪场粪污水中氨氮的去除率为32.5%～53.7%，其去除率比现有报道的复合微生物菌剂的氨氮去除率低[17]。多项研究结果表明，温度是影响固定化微生物菌剂应用效果的重要因素[18-19]。在猪场粪污水中，水温一直在波动，这可能减缓了固定化复合微生物菌剂的除污效果，与陈诚等利用壳聚糖-海藻酸钠固定化菌小球处理猪场沼液的结果[20]相似。同时，固定化微生物菌剂在投加到猪场粪污水的处理过程中，污水底部的缺氧条件不仅会对菌剂的除污效果产生影响，也可能会增加氨氮的产生并释放到水体中[21]。因此，后续研究应适当增加曝气等操作，在一定程度上调节水温和增加水体中的溶解氧，以增强其除污效果。

图2 复合微生物菌剂（WKM-1、WKM-2、WKM-3）的分类和系统发育信息图Fig.2 Classification and phylogenetic information map of WKM-1,WKM-2 and WKM-3

图3 复合微生物菌剂（WKM-1、WKM-2、WKM-3）物种丰度热图Fig.3 Heat map of the species abundance in WKM-1,WKM-2 and WKM-3

复合微生物菌剂WKM的优势微生物主要属于变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）。在多数污水处理工艺的活性污泥中均检测到变形菌门和拟杆菌门这2类菌群。变形菌门（Proteobacteria）菌群有着多种代谢方式，其中的大多数细菌兼性或者专性厌氧及异养生活，在猪场粪污水中适应性强；拟杆菌门（Bacteroidetes）菌群是化能有机营养的专性厌氧杆菌，能代谢碳水化合物，可将复杂的有机物（如纤维素、淀粉等）水解并降解为乳糖、乙酸、甲酸等[22]，除了去除一般水环境污染指标（COD、氨氮）外，还可能对猪场粪污水中难降解的有机物起到一定的削减作用。因此，这2 类菌群能适应微生物在载体挂膜后内部形成的缺氧甚至厌氧环境而进行生长繁殖[23]。放线菌的主要作用是促使土壤中的动植物遗骸腐烂，在自然界的氮循环中也起着一定的作用[24]。猪场粪污水中粪便较多，氨氮浓度较高，适合放线菌的生存，因此，放线菌也是该菌剂的优势菌群。在属水平上，亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）细菌是废水处理系统中典型的氨氧化菌，与废水生物脱氮过程密切相关，在复合微生物菌剂WKM-1、WKM-2、WKM-3 中均检测到亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）细菌，且质量占比较大，进一步证实了WKM 具有良好的除污特性。此外，在该复合微生物菌剂中，白色杆菌属（Leucobacter）、卡斯特兰尼菌属（Castellaniella）、Camelimonas 属、Moheibacter属、亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）、Cloacibacillus属和尼古丁降解菌属（Pusillimonas）微生物的丰度比为2∶2∶2∶2∶1.5∶1.5∶1，可为后续探讨多个单一微生物菌种按比例配制形成的复合微生物菌剂的除污效果提供依据，也便于后续扩大培养进而提高该复合微生物菌剂的实用性。同时，基于COG预测复合微生物菌剂的功能结构表明：该复合微生物菌剂中的微生物对氨基酸、碳水化合物、无机离子等具有的转化和代谢功能，对含高浓度的氨氮和有机污染物的猪场粪污水中蛋白质及脂类等有机物质的转换起到至关重要的作用，能促进污水环境中碳、氮循环[25]，进而加速对猪场粪污水的除污效果，具有潜在的应用和实践价值。

图4 复合微生物菌剂（WKM-1、WKM-2、WKM-3）基于直系同源蛋白簇（COG）的功能丰度热图Fig.4 Heat map of functional abundance in WKM-1, WKM-2 and WKM-3 based on clusters of orthologous groups of proteins(COG)

图5 不同比例麸皮与复合微生物菌剂固定对猪场粪污水COD和氨氮的去除效果Fig.5 Removal efficiencies of COD and ammonia nitrogen in wastewater from pig feedlots treated by the endogenous compound microbial inoculant immobilized with wheat bran of different ratios