植物蛋白磷酸酶2C结构和功能的研究现状与进展

陈耘蕊，毛志君，李兆伟，范凯

（福建农林大学农学院，作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室，福州350002）

蛋白质可逆磷酸化是生物体内一种普遍的调节方式，主要通过蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化完成蛋白质磷酸化和去磷酸化过程，其中，蛋白激酶可以催化蛋白质磷酸化过程，而蛋白磷酸酶可以催化已经磷酸化的蛋白质去磷酸化[1]。在生命活动过程中，蛋白磷酸酶和蛋白激酶主要通过蛋白质可逆磷酸化调控蛋白质的活性与功能，最终激活或抑制相应酶的活性，进而直接或间接影响诸如细胞周期、激素响应以及代谢调控等几乎所有的生命活动过程[2]。

根据底物特异性，蛋白磷酸酶可以分为3 大类：丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（serine/threonine protein phosphatases, STPs）、酪氨酸蛋白磷酸酶（tyrosine protein phosphatases, PTPs）和双重特异性蛋白磷酸酶（dual-specificity protein phosphatases,DSPTPs）[3]（图1）。根据分子生物学结构分析，又可将STPs 分为2 个主要家族：磷蛋白磷酸酶（phosphoprotein phosphatase, PPP），包 括PP1、PP2A、PP2B、PP3 和其他远缘相关的磷酸酶（PP4、PP5、PP6 和PP7 等）；磷蛋白金属磷酸酶（metaldependent protein phosphatase, PPM），主要包括由Mg2＋或Mn2＋依赖性的蛋白磷酸酶2C（protein phosphatase 2C,PP2C）。根据底物的特异性和对特定抑制剂的敏感性差异，PPP 可进一步分为1 型蛋白磷酸酶（PP1）和2 型蛋白磷酸酶（PP2）[3]。其中：PP1的主要功能为特异性催化磷酸化激酶β亚基的去磷酸化过程，并且会受到抑制剂Ⅰ-1（热稳定蛋白）和抑制剂Ⅰ-2（酸稳定蛋白）的抑制；PP2 的主要功能为特异性催化磷酸化激酶α 亚基的去磷酸化过程，并且不会受到抑制剂Ⅰ-1 和Ⅰ-2 的抑制。根据底物的专一性、对抑制剂的敏感性和是否需要二价阳离子，PP2又可分为PP2A、PP2B和PP2C这3类[4]，其中，PP2A 在无二价阳离子存在的情况下具有活性，PP2B 的活性依赖于Ca2＋的存在，PP2C 的活性依赖于Mg2＋或Mn2＋的存在[2]。

图1 蛋白磷酸酶分类Fig.1 Classification of protein phosphatases

目前，在很多植物中发现了蛋白激酶，如玉米[5]、拟南芥[6]、豌豆[7]、小麦[8]和水稻[9]等，并且这些蛋白激酶的磷酸化过程已经被证实参与到许多信号调节活动中，包括光、高盐、激素、干旱、营养匮乏、低温分子应答以及生物胁迫等[10-11]，一些植物的新陈代谢和酶的调节，也存在可逆磷酸化过程。根据其磷酸化底物蛋白的氨基酸残基种类，可将它们分为5类：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶、组氨酸/赖氨酸/精氨酸蛋白激酶、半胱氨酸蛋白激酶、天冬氨酰基/谷氨酰基蛋白激酶[12]。

之前的大部分研究主要集中在蛋白激酶及其调控作用方面，而蛋白磷酸酶仅被看作是简单持家基因编码的酶。随着对蛋白磷酸酶的了解逐渐深入，发现这类酶在涉及磷酸化作用的细胞通路精确调控方面起着巨大的作用。

1 植物中蛋白磷酸酶2C 的结构特点和亚细胞定位

1.1 植物中蛋白磷酸酶2C 的结构特点

PP2C 和PPP 的蛋白质折叠方式相似但具有不同的蛋白质一级结构，PP2C成员需要额外的金属离子才能在体外具有活性[2]，其活性有无与Mg2＋和Mn2＋是否存在相关，失去Mg2＋和Mn2＋会导致PP2C成员丧失活性[13]。例如，螯合剂乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA）可以导致PP2C 酶丧失活性。另外，PP2C 是一种多功能单体蛋白酶，对PPl和PP2A等PPP的抑制剂酒石酸和环孢霉素不敏感[2]。与PPP 不同的是，PP2C 家族缺乏类似于PPP 能够结合其他蛋白质的调节亚基，而是具有能够与催化磷酸酶结构域连接的特殊结构，这赋予了PP2C家族独特的功能和调控机制[14-15]。

PP2C 成员在进化早期以独特的蛋白磷酸酶形式出现，并在古细菌、细菌、真菌、植物和动物中都有发现[16-18]。在真核生物中，所有的PP2C成员在结构上有一个共同特征，即包含11个保守基序的活性催化结构域，该结构域位置位于N 端或C 端[19]。在拟南芥中，大量的PP2C成员（占比为58%）在C端含有该保守结构域，N端具有功能各异的延伸区，但一些拟南芥PP2C 成员，特别是来自于F 亚家族的成员，其结构域主要位于N 末端。N 端延伸区是植物PP2C家族所特有的特征，这些不同长度的延伸区对于PP2C家族的功能存在一定的影响[20]。例如，在拟南芥PP2C 家族中，激酶相关蛋白磷酸酶（kinaseassociated protein phosphatase,KAPP）的N端带有与蛋白激酶直接作用的结构域[19]。对靶蛋白的磷酸化也有重要作用并与底物结合相关的同源区域——DNA 结合蛋白磷酸酶（DNA binding protein phosphatase,DBP）是一个独特的蛋白磷酸酶2C 家族，具有特殊的结合DNA的能力[21]，在拟南芥PP2C成员中DBP1 的N 端具有转录因子的序列特征，能与防御相关基因的启动子区域结合[22]。

植物STPs 的种类和功能均具有多样性。PP2C 作为STPs 中特殊的成员，由于其缺乏与其他蛋白质直接结合的调控亚基，因而可能需要种类繁多的N 端结构域来识别特异性底物和激活蛋白质活性。植物PP2C蛋白中存在一些独特的结构域和基序[23]，结构多样性可能是其功能多样性的重要原因之一。例如，已鉴定出与丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）相互作用的基序——激酶相互作用基序（kinase interaction motif,KIM）[24]。类似于动物的MAPK（MAPKK）或MAPK 磷酸酶已在许多植物的PP2C 成员中被发现，如大多数拟南芥B 亚家族PP2C 成员AP2C1、AP2C2、AP2C4和AP2C3/AtPP2C5[19,25-26]。值得注意的是，在大多数生物的PTPs 中都发现了KIM 的存在，但在植物中PP2C与KIM的进化是同步进行的，因此，KIM 对于调节植物中MAPK 信号转导的PP2C功能活性至关重要。

1.2 植物中蛋白磷酸酶2C 的亚细胞定位

PP2C 家族的亚细胞定位主要位于细胞核上。例如，拟南芥PP2C 成员RDO5[27]、DBP1[21]以及水稻PP2C成员OsSIPP2C1[28]都定位于细胞核上，相似的结果还出现在其他PP2C成员中[29-30]。

此外，一些PP2C 成员也定位于除细胞核外的其他区域，例如，番茄中PP2C 成员SlPP2C1 定位于细胞质中[31]，拟南芥PP2C成员SAG113定位于细胞质中的高尔基体上[32]。另一些PP2C 成员能够同时在不同区域表达，例如，水稻中PP2C 成员OsPP108除主要在细胞核中表达外，部分也在细胞质中表达，其在不同区域的表达都起着关键的作用[33]。

脱落酸（abscisic acid,ABA）信号成分主要包括抗副球菌素蛋白/类抗副球菌素蛋白/ABA调控复合物（pyrabatin resistance/like-pyrabatin resistance/regulatory components of ABA receptors, PYR/PYL/RCAR）受体、PP2C和丝氨酸/苏氨酸激酶，其复合物在细胞核中调节ABA 介导的相关基因表达[34]，但PP2C 在植物的不同部位以及不同生长发育期均能检测到表达。由此可见，PP2C 在ABA 信号调控中具有多条调控途径。

2 植物中蛋白磷酸酶2C 的生物学功能

PP2C 是植物中最大的PP 家族[35]，目前已在多种植物中鉴定出PP2C成员，包括拟南芥[36]、棉花[37]、番茄[31]、杨树[38]、小麦[39]、油菜[40]和水稻[41]等。根据PP2C 成员的序列相似性以及进化关系，可将PP2C成员分为不同的亚家族，每个亚家族包含不同比例的PP2C 成员[20]。不同亚家族在功能上也各自具有不同的特点。例如，A亚家族中的PP2C成员能响应ABA的信号转导过程[42]，是植物中ABA响应的负调控因子[43]。PP2C家族在调节植物生长发育、响应生物和非生物胁迫、激素信号转导等方面都具有重要作用[19]。

2.1 在植物生长发育中的作用

PP2C 家族在植物生长发育过程中的调控作用主要包括种子休眠萌发[44]、根系生长[45]、细胞扩增[46]、干细胞分化[47-48]和器官发育[49]等方面。

1）细胞扩增和分化。高等植物生长进程中器官形成主要来源于胚胎发生过程中形成的茎尖分生组织。植物干细胞位于分生组织的顶端，对于维持分生组织的功能、调节干细胞的增殖以及将细胞转变为能够形成器官原基的过程至关重要。现已发现多个PP2C家族基因对于植物分生组织中的干细胞增殖存在直接或者间接的调控作用。例如，由POL（poltergeist）基因编码的PP2C成员能调控拟南芥分生组织中干细胞的增殖和分化。受体激酶CLAVATA1（CLV1）可以调节拟南芥芽和花分生组织中的干细胞积累[50]，其clv突变体中芽和花分生组织上的干细胞过度积累，而pol clv双突变体中茎和花分生组织上的干细胞积累减少，但是pol 单突变体表现出较pol clv双突变体更多的干细胞积累表型，表明POL 对CLV1 具有正向调控作用[45]。另外，PP2C的一个重要成员KAPP在CLV1信号调控中起负调控作用，可直接与包括CLV1 在内的许多受体激酶相互作用[51]。SONG 等[50]在拟南芥中分离出与POL 结构相似的5 个PP2C 成员并命名为POL-like genes1-POL-like genes5（PLL1-PLL5）。其中，POL和PLL1 在调节花梗和胚胎发育方面具有相似功能，而PLL4和PLL5主要调节叶片发育。

2）植物种子的休眠与萌发。植物种子的休眠与萌发是植物从生殖生长转变为营养生长的重要节点，许多PP2C成员在此过程中发挥着重要作用。一些PP2C成员仅与种子休眠有关，例如，XIANG等[27]发现，PP2C 成员RDO5（REDUCED DORMANCY5）是种子休眠特异性基因，可在不影响植物其他性状的情况下调节种子休眠。更多的PP2C成员在影响种子休眠或萌发的情况下，也会影响植物的其他性状，例如，拟南芥PP2C 家族B 亚家族成员PP2C5 可正向调节种子萌发以及气孔关闭过程[26]，而在拟南芥中发现的另一个B亚家族成员AP2C1也被证实与种子的萌发和气孔关闭过程相关[30]。植物激素ABA能够调控种子休眠与萌发，PP2C蛋白主要通过ABA信号途径调控种子的萌发与休眠过程。拟南芥中ABA响应的负调控因子AHG1（ABA HYPERSENSITIVE GERMINATION 1）[52]，能与休眠特异性基因DOG1（DELAY OF GERMINATION 1）[53]相互作用，DOG1可调控AHG1 的PP2C 酶活性，说明AHG1-DOG1复合物可能是ABA调控途径中的重要部分[51]。

3）器官发育和果实成熟。器官发育对植物十分关键，直接决定了植株产量与品质。PP2C成员在许多不同植物的器官发育以及果实成熟过程中均具有重要作用。例如：野生大豆ZYD7 的等位基因PP2C-1 有助于种子质量的增加[54]；拟南芥PP2C 家族E 亚家族基因AtPP2CF1 能诱导根尖和年轻的发育叶片的基部区域细胞快速分裂，加速花序茎生长，增加生物产量[55]；拟南芥PP2C成员AP2C3在气孔发育过程中显著表达，AP2C3的异位表达植株能刺激细胞增殖和促进气孔发育[25]。PP2C 成员在促进植物果实成熟过程中起着重要作用。拟南芥中，ABA极不敏感基因ABI1和ABI2都属于PP2C家族，二者通过ABA信号转导途径对植物逆境胁迫、细胞分化和生长都存在负调控作用[56-58]。JIA 等[59]在草莓中分离了拟南芥ABI1 的同源基因FaABI1，并发现在草莓果实发育过程中其mRNA 表达量迅速下降，通过在草莓中基因沉默和过表达FaABI1基因来改变与ABA 信号转导和成熟相关的基因如ABI3、SnRK2、ABRE1、PG1 和PL1 等的表达水平，进而可调控草莓果实的成熟进程。在番茄中被鉴定出的属于PP2C家族A亚家族基因SlPP2C1[31]，可在幼果的果皮、维管束、种子和果肉中表达，通过干扰SlPP2C1 的表达可以加速果实成熟，表明SlPP2C1可能与果实的发育和成熟有关。

2.2 在激素信号转导中的作用

PP2C 成员在激素信号转导中具有非常重要的作用，主要包括脱落酸（ABA）[60]、茉莉酸（jasmonic acid, MeJA）[26]和 水 杨 酸（salicylic acid, SA）[61]等途径。

1）脱落酸途径。目前的研究主要集中在脱落酸途径的调控机制方面。植物激素脱落酸在生物胁迫响应[62-63]、非生物胁迫响应[31,33,43,64]和发育过程[65-66]中具有重要的作用。ABA信号转导途径是一个复杂的网络[42]，PP2C 家族是ABA 信号网络中一个关键的家族[67]。有研究表明，PYR/PYL/RCAR 的ABA受体[68]以ABA依赖性方式调节PP2C家族中A亚家族成员。参与ABA信号调控的PP2C成员通过脱磷酸作用与ABA 激活的SNF1 相关蛋白激酶2（SNF1-related protein kinase 2, SnRK2）相互作用并使其失活，而其在ABA 存在的情况下可通过PYR1抑制失活作用[42,69]。NISHIMURA 等[68]在拟南芥中发现，与ABI1 相互作用的蛋白质中有9 种PYR/PYL/RCAR 蛋白，用ABA 处理5 min 可促使ABI1-PYR1 相互作用，同时，pyr1/pyl1/pyl2/pyl4 四突变植株对ABA 诱导的气孔开闭具有很强的不敏感性。这些发现均表明，ABI1 可以与拟南芥中的多个PYR/PYL/RCAR成员相互作用。大量研究证明，在不同的植物中PP2C成员在ABA信号转导途径中均具有作用，例如：胡杨PP2C 家族基因PeHAB1 可在外源ABA诱导下表达[70]，而在拟南芥中通过异位表达PeHAB1 获得的转基因株系对外源ABA 的敏感性降低；毛果杨PP2C 家族A 亚家族基因PtrHAB 可调节ABA 信号转导过程[38]；欧洲山毛榉中PP2C 成员FsPP2C2 只在ABA 处理的组织中尤其是在种子中表达，在ABA和钙离子（Ca2＋）共同作用下转录水平明显升高，而钙螯合剂（EGTA或TMB-8）的加入降低了其表达水平[71]。

2）茉莉酸与水杨酸途径。茉莉酸、水杨酸和脱落酸都是植物的内源激素，也都具备调节植物生理活动的作用。水杨酸在各种逆境胁迫下都发挥着重要作用，包括影响植物细胞的膜透性、调节植物渗透物质含量、提高各种防御酶的活性以及增加光合色素含量等[72]。PP2C 家族也可以调控水杨酸（SA）和茉莉酸（MeJA）的信号转导途径。脱落酸和水杨酸之间的相互作用影响植物对各种胁迫的响应[61,73]。MANOHAR 等[61]发现，在ABA 存在的情况下PP2C 成员PP2C-D4、ABI1 和ABI2 与SA 类似物3AESA 的结合增强，表明PP2C-D4、ABI1 和ABI2与ABA和SA以协作的方式结合。茉莉酸在调节植物的开花时间、花器官发育、花发育进程以及防御反应中均具有重要作用。PP2C 蛋白在MeJA 信号调控途径中具有显著作用，例如SCHWEIGHOFER等[26]研究发现，PP2C 成员AP2C1 与植物免疫相关，ap2c1 突变体植株在受伤时会产生大量的茉莉酸酯，增强了对植食性螨虫的抵抗力，同时，过表达AP2C1 的植株伤口处MAPK 的活性降低。该研究结果证明，AP2C1在调节拟南芥的MeJA激素水平、防御反应和MAPK活性方面起着关键作用。

2.3 在逆境胁迫下的作用

植物经常受到各种外来生物和非生物因素的影响，对植物本身的生理生长过程造成不利影响，此时植物生长则处于胁迫或逆境状态。对植物产生重要影响的逆境主要包括干旱、低温、高温、土地盐碱等非生物逆境以及病虫杂草等生物逆境。非生物逆境之间通常是相互联系的，如大多干旱胁迫通常伴随着土地盐碱和高温逆境，可以引起植物体内活性氧的积累并引发植物器官提前衰老[74-75]。植物对逆境的抵抗也存在共同的机制，如植株在低温驯化过程中产生的低温抗性，通常也能增强植物的抗旱能力[76]。

1）生物胁迫。PP2C 成员对生物胁迫如细菌侵染[77]等都存在明显的调控作用。在水稻中筛选出的与受体激酶XA21 结合的PP2C 蛋白XB15，其xb15基因突变体表现出严重的细胞死亡表型，诱导了致病相关基因的表达，增强了XA21介导的植株抗性，表明xb15对XA21介导的非特异性免疫应答具有负调控作用[78]。HU 等[79]从水稻中克隆出PP2C 成员OsBIPP2C2a，其在转基因烟草中过表达导致植株对烟草花叶病毒的抗病性增强，表明OsBIPP2C2a 可能通过激活防御反应在抗病性中发挥重要作用。

2）非生物胁迫。PP2C 成员对诸如创伤[26]、干旱[80]、盐胁迫[81]和低温胁迫[82]等非生物胁迫也存在明显的调控作用。水稻中OsSIPP2C1 是参与非生物胁迫和早期穗发育的PP2C蛋白[28]，可以响应盐胁迫和干旱胁迫，OsSIPP2C1 主要受ABL1 负调控而参与ABA调节。此外，OsSIPP2C1主要在穗中进行大量表达，且随着水稻穗的发育其表达逐渐增加。在穗发育的早期，OsSIPP2C1 积累并可能负调控ABA信号转导途径，而在穗发育的后期，OsSIPP2C1的表达降低以确保ABA 在促进穗成熟中起作用。另外，OsSIPP2C1 可能在MADS 转录因子的调控下参与穗的早期发育。

目前，已发现大量PP2C 成员参与非生物胁迫过程。在玉米中发现大多数PP2C家族A亚家族成员ZmPP2C-A 的表达受到多种胁迫（如干旱、盐和ABA）的强烈诱导，并在这些胁迫下大量表达，从而减少水分损失，降低脯氨酸积累量，提高植株的存活率[43]。小麦PP2C成员PP2C-a10与TaDOG1L1和TaDOG1L4 相互作用使小麦种子在萌发阶段对ABA的敏感性降低和对干旱胁迫的耐受性降低[83]。与野生烟草相比，在低温胁迫下ZmPP2C2异位表达植株的发芽率和抗氧化酶活性都更高，而电解质渗漏率和丙二醛含量则更低[84]。在拟南芥中发现，ABA 突变株abi2-3 在盐胁迫下AtPP2CG1 表达水平明显低于野生型植株，同时，AtPP2CG1的过表达增强了植株的耐盐性，表明AtPP2CG1以ABA依赖的方式调控盐胁迫[85]。从小麦中分离鉴定的PP2C成员TaPP2C1 在ABA 和NaCl 处理下均被下调表达，而在烟草中TaPP2C1 过表达植株的抗盐性增加，活性氧积累减少，抗氧化系统被改善，ABA非依赖途径基因表达上调[86]。这些结果表明，TaPP2C1与ABA信号转导和植物耐盐性有关。

由此可见，PP2C成员广泛参与植物对逆境胁迫的响应调控，且涉及的物种众多，参与的反应过程复杂多样。PP2C 成员通过对逆境胁迫响应可间接调控植物的生长发育过程，对种子的休眠萌发、器官发育、果实成熟等都具有调控作用。

3 小结与展望

PP2C家族在真核生物中普遍存在，由于植物中存在大量复制事件，所以高等植物比其他真核生物存在更多的PP2C成员[3,87]。在植物中，PP2C成员能直接与激酶、调节蛋白等结合来调控相关基因的表达[66]，进而调控植物的生长发育、逆境胁迫等生命活动过程[20]。植物的产量和品质受到基因的调控，通过改变植物生长发育相关基因，调控植物的生育期，能够在一定程度上达到增加植物产量、改善植物品质的作用。已经报道的PP2C成员中有部分与植物的休眠萌发、细胞分化、器官发育和果实成熟等生长发育调控过程相关，这些研究结果为提高植物产量和改良植物品质提供了技术支撑和保障。另外，植物产量和品质还与环境条件有关，其中各种生物和非生物胁迫均会导致产量降低、品质下降。目前，已报道许多PP2C 成员在植物对各种生物和非生物胁迫的应答中起重要作用，能够增强植物对各种逆境胁迫的抗性。这些研究为获得更多具有抗逆性的植物品种，提高植物存活率和改善品质，进一步促进农业体系的稳定发展具有重要的作用和意义，但对于这些PP2C 蛋白在植物生长发育和逆境调控过程中的调控途径以及具体的作用底物、作用机制的研究仍然不足，值得更加深入探索和研究。

PP2C所涉及的调控网络复杂多样，几乎涉及植物生命活动的所有过程，目前研究发现PP2C 成员为脱落酸信号通路的核心组成部分。脱落酸是一种常见的植物激素，在许多生理过程中起着至关重要的作用，例如调节种子胚的发育、调节气孔开闭、影响植物分化以及对非生物胁迫的适应性反应等[88]。探究调节ABA 信号转导的调控因子对于研究ABA 及其相关成分在植物生理过程中的功能具有重要价值。目前，已在植物中发现ABA信号转导途径中的3 种核心部分，即ABA 受体PYR/PYL/RCAR 蛋白、负调控因子PP2C 和正调控因子SnRK2[89]，它们共同组成了一个双重负调控系统PYR/PYL/RCAR-PP2C-SnRK2来调控ABA信号转导途径及其下游反应[90]。越来越多的学者开始探究PP2C 的受体和作用底物[91-92]并研究其作用机制[93]。例如TAKEUCHI 等[69]根据ABA 的PYL-PP2C 受体系统的结构机制，设计了PYL-PP2C 相互作用的拮抗剂。寻找PP2C作用抑制剂或阻断受体，对于调控PP2C 相关的调控途径进而调控植物的生长发育和生理过程具有重要意义。此外，近年有研究发现，DOG1 和AHG1 可能构成了与PYR/PYL/RCARPP2C-SnRK2平行的ABA调控途径，其中DOG1可通过结合血红素进一步起作用，而DOG1-AHG1复合物可以调节下游基因，包括SnRK2s 和ABI5[52]，其他更多的细节还需要进一步的研究。对于PP2C成员在其他植物激素转导途径中以及在其他生命活动中的作用机制值得进行更加深入的研究。

综上所述，PP2C蛋白酶在植物中具有多种表达模式和亚细胞定位，可广泛作用于植物发育的各个阶段和各个部位，以及应对各种生物和非生物胁迫。目前，仍然有大量的植物PP2C 成员未被发掘研究，也有众多问题值得去探讨。例如：PP2C 在ABA 调控中的作用网络如何构建；除PP2C 家族A亚家族外，其他亚家族还具有哪些共同作用。而随着生物工程技术的发展，各项生物技术越来越完善，为探究PP2C 成员的高级结构、功能多样性、作用底物以及调控机制等各方面的研究提供了技术支持，可为解决一系列农业相关问题提供可行方案。