亚低温治疗对脓毒症小鼠血清可溶性髓样细胞触发受体1及炎症因子水平的影响▲

石齐芳 杨光耀 李言鹏 王树云 盛 鹰

(上海市浦东医院急危重医学科，上海市 201399，电子邮箱：shiqifang456@163.com)

低温可以减缓机体的代谢，降低氧耗，保护线粒体功能，减少缺血缺氧所致的细胞凋亡以及自由基产生，抑制炎症反应[1]。脓毒症是宿主对感染反应失控的结果，对脓毒症患者采用低温疗法可能有一定的效果[2]。但有关亚低温用于治疗脓毒症效果的研究结果并不一致[3-4]，其中有临床研究显示亚低温并不能改善脓毒症/脓毒症休克患者的预后[5-7]。髓样细胞触发受体1( triggering receptor expressed on myeloid cell 1,TREM-1)是一种新型炎症激发细胞膜受体，在炎症触发和级联放大的反应中作用突出。可溶性TREM-1(soluble TREM-1,sTREM-1)是TREM-1的可溶形式，在脓毒血症中得到了广泛的研究[8]。但亚低温对脓毒症患者sTREM-1水平的影响鲜见研究报告。本研究利用脂多糖腹腔注射方法建立脓毒症小鼠模型，观察34℃～36℃干预性亚低温治疗对脓毒症小鼠炎症因子水平及sTREM-1水平的影响，探讨亚低温疗法调控脓毒症小鼠机体炎症反应的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体级7周龄BALB/c雌性小鼠84只，体质量20～25 g，由中科院斯莱克实验动物有限公司提供[许可证号：SYXK(沪)2015-001]，适应性喂养1～2周。

1.2 分组与建模 采用随机数字表法将小鼠随机分为正常对照组、脓毒症组、亚低温组，每组28只。脓毒症组和亚低温组采用腹腔注射10 mg/kg脂多糖建立脓毒症小鼠模型，正常对照组给予腹腔注射同等剂量的生理盐水。建模方法[9]：(1)用生理盐水将脂多糖稀释成1 mg/mL；称重小鼠后剃除其下腹体毛，暴露表皮，用70%的酒精消毒后于下腹部偏外侧注射脂多糖或生理盐水。注射脂多糖后小鼠出现活动减少、寒战、抱团取暖、拒绝食水、抓取时逃避无力、呼吸频率加快等说明造模成功。造模成功后1 h采用小鼠肛温仪(北京鸿鸥成运仪器公司，型号：TH-212)测量肛温，正常对照组和脓毒症组小鼠正常饮食，不给予任何处理，亚低温组给予物理降温法降温，使小鼠肛温维持在34℃～36℃。肛温波动在0.5℃～1.0℃之间。本研究经医院实验动物伦理委员会批准(审批文号：2017-D26)。

1.3 观察指标 (1)分别于建模后6、12 h，采用随机数字表法每组各取8只小鼠，取眼眶血1.0 mL置于普通试管，放于4℃冰箱中保存2 h，使用离心机以4 000 r/min常温离心15 min，取上清液置于EP管中，放置于-80℃冰箱保存待检。采用酶联免疫吸附试验检测血清肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)、sTREM-1水平，试剂盒均购自华美生物工程有限公司，操作按说明书进行。于建模后12 h，采集血液标本后处死小鼠，剖开腹腔观察肠黏膜情况，如肠黏膜、腹腔脏器充血水肿，再次证明建模成功，本研究脓毒症组和亚低温组小鼠均建模成功。(2)建模成功后12 h，观察每组其余20只小鼠的存活率。

1.4 统计学分析 采用SPSS 24.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组小鼠血清TNF-α、IL-6、sTREM-1水平的比较 建模后6、12 h，与正常对照组相比，脓毒症组和亚低温组小鼠血清TNF-α、IL-6、sTREM-1水平升高，且脓毒症组高于亚低温组(均P<0.05)，见表1。

表1 3组小鼠血清TNF-α、IL-6、sTREM-1水平比较(x±s， ng/L)

2.2 3组小鼠建模后12 h生存情况的比较 正常对照组、脓毒症组和亚低温组小鼠存活率分别为100.0%(20/20)、35.0%(7/20)、55.0%(11/20)，组间差异有统计学意义(χ2=19.091,P<0.001)，正常对照组小鼠存活率高于脓毒症组和亚低温组(P<0.05)，但亚低温组与脓毒症组存活率差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

促炎细胞因子和抗炎细胞因子之间动态平衡的破坏，可能是脓毒症发生和发展的重要机制[10]。在脓毒症早期，炎症介质可在1～6 h内迅速升高达到高峰，部分在12 h达到高峰，之后迅速下降， TNF-α是脓毒症启动时最早出现也是最重要的炎症因子，可迅速达到峰值，并进一步促进IL-1、IL-6等细胞因子的大量释放。IL-6主要由IL-1、TNF-α诱导释放，持续时间持久，是反映脓毒症病情严重程度的重要指标[11]。TREM-1是一种在中性粒细胞、成熟的单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞上表达的免疫受体，是一种重要的脓毒症免疫反应的中介分子，其可促进炎症级联反应[12]。sTREM-1为TREM-1的可溶形式，TREM-1的水平越高相应的sTREM-1的水平越高。越来越多的研究表明TREM-1是脓毒症的重要标志物，对诊断和评估预后具有重要意义[13]。有研究显示，TREM-1抑制剂可以减轻脓毒症模型大鼠的炎症反应，保护器官功能，维持血流动力学稳定，延长脓毒症大鼠的存活时间[14-15]。

有实验研究表明，体温管理可以影响脓毒症炎症介质的变化。例如，Ding等[3]利用盲肠结肠穿孔法建立脓毒症大鼠模型，并观察亚低温治疗脓毒症大鼠的疗效，结果显示亚低温(34℃)治疗的脓毒症大鼠IL-6、高迁移率族蛋白B1水平低于体温维持在38℃的脓毒症大鼠，24 h生存率更高；Léon 等[16]也发现，亚低温(34℃)能降低脓毒症大鼠血浆TNF-α和IL-6水平，抑制促炎反应；而Rim等[4]发现治疗性亚低温(30℃～32℃)对严重脓毒性休克大鼠具有良好的治疗作用，但对中度脓毒症大鼠无明显保护作用。这些动物实验研究结果提示亚低温对脓毒症有潜在的治疗作用。本研究结果显示，脓毒症小鼠的血清TNF-α、IL-6及sTREM-1均较正常小鼠升高，而给予亚低温干预后，脓毒症小鼠的TNF-α、IL-6及sTREM-1水平均降低(P<0.05)，提示适当的低温可抑制内毒素所致的机体过度炎症反应；但亚低温组小鼠存活率与脓毒症组差异无统计学意义(P>0.05)，提示亚低温治疗对脓毒症小鼠存活率的影响还需进一步研究。

但啮齿动物模型和人类脓毒症表型仍有差异，将动物实验研究结果外推到脓毒症患者上，仍需要更多的研究支持[17]，且近期的临床研究并没有取得预期效果。例如Mourvillier等[7]报告亚低温(32℃～34℃，48 h)并不能改善重症细菌性脑膜炎患者的预后，甚至可能有害，并提出在亚低温试验中需仔细评估安全性问题。Gao等[5]将核心体温≥39℃的脓毒症患者随机分为低温组(36.5℃～38℃)和高温组(38.5℃～39.5℃)，处理后6 h内达到相应靶核温度并维持24 h，结果显示低温组患者的促炎细胞因子水平降低，但是生存率也降低，提示过度的温度控制可能对脓毒症患者有害。一项随机、对照、开放性实验结果显示，在呼吸机依赖型呼吸衰竭的脓毒症休克患者中，诱导性低温并不能降低死亡率，且有可能延迟几个关键器官功能的恢复[6]。临床研究和动物实验的结果存在较大差异，主要原因可能是人体体温的降低通常需要数小时来诱导，这时可能已经发生组织损伤；另外动物模型所纳入的动物大多数属于幼龄，而脓毒症患者以老年人居多，这种年龄的差异可能也是导致研究结果不尽一致的原因[3]，但还有待研究证实。

综上所述，亚低温治疗能降低脓毒症小鼠血清sTREM-1及炎症因子水平，减轻炎症反应。然而，如何使脓毒症患者从温度管理中获益，目前仍然缺乏令人信服的证据[18]，亚低温治疗对脓毒症的影响需更多的研究来阐明。