Meta分析帕金森病患者与肠道乳酸杆菌量的关系

荣婷1，滕文慧，高杏娜1，丁鸿斐1，姜英1，王乃东

(1. 青岛大学医学部，山东 青岛 266071；2.青岛大学附属医院，山东 青岛 266071)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)常见于中老年人[1]，我国年龄>65岁的老年人中，患病率为1.7%[2]。PD以运动迟缓、肌强直、静止性震颤以及姿势步态异常为特点，常伴有一些非运动症状，如：嗅觉减退、便秘、焦虑、抑郁、快速动眼睡眠障碍、白天过度嗜睡等。这些症状与黑质致密部中多巴胺能神经的进行性缺失以及主要由α突触核蛋白形成的路易体(Lewy Body，LB)增加密切相关，也与肠道菌群有着密不可分的关系。在人体中，细菌数目与有核细胞总数数目之比为10∶1，微生物群的基因是人类基因组的100倍[3]。绝大多数细菌位于结肠中，约1014种。有文献[4]证实：粪便中含19个细菌群/属，包括：①占优势的6种厌氧物种(拟球梭菌、柔嫩梭菌、脆弱拟杆菌、双歧杆菌、奇异菌和普雷沃菌)；②5种潜在的病原体(产气荚膜梭菌、肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌和假单胞菌)；③8种乳酸杆菌(格氏乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鲁氏乳杆菌和清酒乳杆菌)。近年，发现这些细菌具有改变宿主代谢、免疫等多种功能，与PD等疾病的发生密切相关。在本研究中，我们采用Meta分析的方法，探讨帕金森病与肠道乳酸杆菌量的改变关系。

1 资料和方法

1.1 检索策略 我们从PubMed、Embase、Cochrane、Clinicalkey数据库中搜索了从开始建库到2019年4月的文章；知网、万方数据库从建库到2020年7月的文章;纳入研究中所引用的参考文献，手工检索相关会议、论文、报告。最终检索于2020年7月完成。检索词有Parkinson’s disease、PD、lactobacilli、intestinal flora、帕金森、肠道菌群等。

1.2 文献纳入、排除标准 纳入标准：①病例对照研究；②全文文献；③研究对象：人；④研究内容：人体肠道内的乳酸杆菌；⑤PD组和对照组一般资料差异无统计学意义，有可比性；⑥当多个出版物报告从相同群体获得的数据时，仅选择具有最大样本的研究；⑦有提供足够的数据可以进行Meta分析。排除标准：①动物实验；②非病例对照研究；③自身对照试验；④数据不完整或报道信息太少且联系不上作者以至于无法使用的文献；⑤通过各种方法均未获得原文；⑥原始研究中的数据，本研究无法使用者；⑦在过去3个月内摄入抗生素药物或摄入益生菌或益生元产品；⑧有急性或慢性胃肠道疾病史；⑨综述；⑩结局指标不明确或为非量化指标如图像等。

1.3 文献筛选和资料提取 见图1，由2名评价员独立阅读文献标题及摘要，选择符合纳入标准的文献并进一步阅读全文，如果意见相左，由第3名研究员与2名研究员共同讨论决定。从每个文献中提取以下信息：第一作者、出版年份、对照组和病例组的数量、研究对象、研究方法、结局指标。如果文章中没有这些信息，则通过电子邮件联系该出版物的作者，并要求提供更详细的信息。

1.4 文献质量评估 纳入文献均使用非随机研究系统评价工具纽卡斯尔-渥太华量表(Newcastal-Ottawa Scale，NOS)[5]进行评价。包括3个类别8个条目，分别是：①选择：含4项条目，即病例确定是否恰当、病例代表性、对照组的选择、对照组的确定；②可比性：含1项条目，即研究设计或统计分析中病例与对照者的可比性；③暴露：含3项条目，即暴露因素的确定、是否采用相同的方法确定病例和对照者的暴露因素、有无应答率。采用NOS分别对研究对象选择、组间可比性、暴露因素和结局进行评价：①研究对象选择，共计4分；②组间可比性，共2分；③暴露因素和结局，共3分；总的评分为9分。按NOS评分标准：>6分为高质量文献；等于6分者为中等质量文献；<6分者为低质量文献[6]。

图1 文献检索流程

1.5 统计学方法 采用Cochrane协作网的Revman 5.3 软件进行Meta分析。对连续性变量采用标准化均数差(SMD)以及95%置信区间(CI)表示效应指标分析结果。绘制森林图，用于描述Meta分析的统计结果，以α=0.05为检验标准。各纳入研究结果间采用I2检验进行异质性检验，根据判断异质性大小，I2<50%表明异质性尚在可接受范围内；I2>50%为不可接受。若纳入研究结果同质性好(P>0.1，I2<50%)，采用固定效应模型(fixed effects model)描述进行Meta分析，否则，则采用随机效应模型(random effects model)进行Meta分析。对异质性大的结局指标进一步根据评分表不同而进行亚组分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 文献检索结果及特征 根据纳入标准和质量控制要求，剔除不符合要求的文献(见图1)。最终纳入5篇文献，均为病例对照的全文文献。共641例研究对象，其中病例组371例，对照组270例。纳入文献的一般情况见表1、表2。

2.2 纳入文献的质量评价 纳入文献均使用非随机研究系统评价工具NOS量表进行评价，总分为9分。见表2。

表1 纳入文献的一般情况

表2 纳入文献的一般情况及质量评价

2.3 Meta分析结果 纳入病例组371例，对照组270例，共计5个公开发表的病例对照研究，对其基线资料进行对比，结果表明无差异；所有纳入文献均严格遵守文献质量评估量表，以确保纳入文献的质量，最高分7分，最低分6分，提示纳入文献质量高。对PD患者肠道内乳酸杆菌的定量分析以均数±标准差形式展示出来。因异质性较大(I2=77%)，所以采用随机效应模型进行合并分析。结果显示：SMD=0.61，95%CI：0.23～0.99，P=0.001。即PD患者粪便内的乳酸杆菌的量要高于对照组(见图2)。

图2 PD患者粪便乳酸杆菌的Meta分析森林图

Meta分析异质性大，可能与原始研究质量的异质性有关，通常可以采用亚组分析处理。考虑到国内外饮食结构对乳酸杆菌的影响[12]，我们将5个原始研究分为2组。中国组SMD=0.88，95%CI：-0.55～2.30，国外组SMD=0.46，95%CI：0.24～0.28，I2=30%。两组95%CI之间有重叠，表明很可能不存在交互作用。图3显示，国外组P=0.24>0.05，我们认为同质性较好，且样本量较大，结果准确性较高；国内组P<0.05，横线、菱形与垂直线相交，表明结果可能无统计学差异。 即国外组PD患者粪便内乳酸杆菌量比对照组高，差异有统计学意义；国内组未见差异。

2.4 纳入文献偏倚分析 我们对每一个纳入文献均进行了偏倚评估，结果见图4、图5，结果显示：未见明显偏倚。因纳入文献少于10篇，发表偏倚漏斗图无意义，因此，本研究未做偏倚漏斗图。

3 讨论

PD是仅次于阿尔茨海默病(AD)的第二大神经退行性病变，主要有两大病理特征，一是黑质多巴胺能神经元及其他含色素的神经元大量变性丢失，尤以黑质致密区多巴胺能神经元丢失最为显著，出现临床症状时，至少减少50%以上；二是残留神经元胞浆内出现嗜酸性包涵体，即LB，此系由细胞质蛋白所组成的玻璃样团块，其中央有致密的核心，周围有细丝状晕圈。α突触核蛋白、泛素、热休克蛋白等是其形成的主要成分。在神经变性条件下，神经元中的组蛋白乙酰化水平总体下降。关于PD具体发病机制目前尚不十分清楚。有研究发现[13]：PD发病机制可能与乳酸杆菌有关。许多乳酸杆菌胞内有高浓度的锰元素，这些锰元素可沿着迷走神经入脑，避免了血脑屏障的阻碍作用，最先损害的是蓝斑，从而导致了PD、AD、自闭症等的发生[14]。因此，通过检测肠道乳酸杆菌量的多少，可能可以预测PD的发病情况。

图3 PD患者粪便乳酸杆菌的亚组分析

图4 偏倚风险图

图5 偏倚风险总结图

为了明确PD和肠道乳酸杆菌量的关系，我们对PubMed、Embase、Cochrane、Clinicalkey、中国知网、万方等数据库中公开发表的文献进行了Meta分析。亚组分析结果显示：粪便内乳酸杆菌量的增加，可能与PD发病相关，这与Samsel A等[14]的研究结果一致。近年来，学界提出了“微生物-脑-肠轴”的概念，可能是肠道菌群引起PD的机制之一[3]。最初对“微生物-脑-肠轴”的研究，多见于肠易激综合征、炎症性肠病[15]。“微生物-脑-肠轴”包括中枢神经系统，内分泌免疫系统，下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)，自主神经系统，肠神经系统和肠道微生物群[16]。这是一条双向轴，大脑控制胃肠道的神经、分泌和免疫的同时，也接受来自胃肠道的反馈信息。肠道菌群对神经系统的作用途径，除了“微生物-脑-肠轴”这一通路，也可以经过以下方式：如免疫系统，肥大细胞-微生物群-神经细胞；内分泌系统，神经内分泌-下丘脑-垂体-肾上腺轴[3]；以及通过改变溶酶体清除机制、线粒体自噬等程序性死亡的方式引起PD[17]。有学者[3]认为PD是一种炎症性疾病，神经炎症可引起α突触核蛋白的聚集。肠道炎症免疫系统的信号分子、细胞因子、趋化因子等都经过迷走神经或外周器官[18]，从肠神经系统分阶段传播至中枢神经系统[19]，导致后者发生一系列的炎症反应，最终引起PD[3]。然而，迷走神经在PD发病中的作用还有争论。Liu BJ等[20]的临床试验结果证明：迷走神经切断术与PD患病风险无关。这与Svensson E等[21]的队列研究结果(完全截断迷走神经可以降低PD的发病率)相悖。

早在2011年，Nair AT等[3]就证明了PD患者肠道通透性的改变、氧化应激与α突触核蛋白有关。这些学者倾向于：除了肠道的炎症，应激反应也导致了α突触核蛋白在脑部的聚集。局部的肠道炎症可因氧化应激、线粒体功能障碍、能量产生等原因，使其通透性增加、肠道屏障作用减弱，损伤部位的细菌产物、炎症介质可入血[3]。如：在啮齿动物模型中，使用神经毒素1-甲基-4苯基 -1，2，3，6四氢吡啶 (MPTP)，后者可在体内转换为其生物活性形式1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)，MPP+可在神经胶质细胞内的单胺氧化酶(MAO-B)、多巴胺转运蛋白(DAT)的作用下进入多巴胺神经元，最终，导致其氧化应激的发生、线粒体功能障碍[22]。在一项母体分离的婴儿恒河猴肠道菌群完整性的试验中，也证明了乳酸杆菌与应激反应相关[23]。在最近的研究中发现[24]，PD患者肠道内乳酸杆菌量的增加，也可能是体内的一种重要保护防御机制。乳酸杆菌可以下调PD患者的IL-1、IL-8和TNF-α、抑制肥大细胞脱颗粒，也可以调节其它共生微生物、并抑制病原体黏附于肠壁[25]，还可以促进Th1细胞的转换[26]，从而发挥其抗炎效应。此外，在表达α-Syn Y39C的小鼠实验中，已经证实微生物的产物，如，丁酸钠和苯基丁酸钠等丁酸盐，可减少α-Syn寡聚化、LB形成，从而改善运动和认知功能[27]，也可减少纹状体的神经炎症反应和氧化应激反应，并且可以提高纹状体的多巴胺(DA)、脑源性神经营养因子、组蛋白的乙酰化[28]，具有保护PD等神经保护性大脑活动。然而，也有人认为：丁酸盐可促进小胶质细胞介导的免疫反应和增加α-突触核蛋白的聚集，进而导致运动异常[29]。

综上所述，PD患者肠道内乳酸杆菌量的改变既可以是保护因素，也可以是患PD的危险因素。我们考虑，这可能和乳酸杆菌的复杂种类有关。在乳酸杆菌属中，每种属的细菌，作用不尽相同。例如：德式乳杆菌，可增加IL-10、IL-4的浓度，在嗜酸乳杆菌中，观察到IL-2、IL-12增加，这二者均可导致炎症反应；香肠乳杆菌可以抑制应激反应、降低下丘脑(HPA)的高反应性而使肠道通透性降低[30]，从而起到保护性作用。

总之，PD患者乳酸杆菌的含量增高，提示该菌参与了PD的发生和发展过程。需要区分乳酸杆菌的各个属，才能判断乳酸杆菌量的增加到底是PD的保护因素还是危险因素。本文尚存在一些缺陷。由于纳入的研究数量偏少，因而未能进行漏斗图分析。