PDGFA在鼻咽癌中的差异表达及其功能分析

唐玉莲，陈启威2，韦贵将2，李玉颖，候沅林，卢诗丽，刘洁兰，王太重

(1. 右江民族医学院医学检验学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国南部及东南亚地区高发的一种恶性肿瘤，因其起病隐匿、淋巴结转移早、恶性程度高等，患者生存率一直较低[1]。血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor subunit，PDGF)是体内一种重要的促细胞生长和诱导分化因子，近几年研究发现其与肿瘤的发生发展密切相关，尤其在肿瘤细胞黏附、迁移、血管生成和浸润转移中起重要作用[2]。PDGF家族包含许多成员，而PDGFA是PDGF家族成员的一种，以二聚体形式存在。PDGFA与膜上相应受体——PDGF受体(PDGFreceptor，PDGFR)结合后可促使受体分子形成二聚体，激活细胞内结构域，酪氨酸残基磷酸化，从而将胞外信号传入胞内，经级联放大效应调控细胞的分裂和增生。多项研究表明[3-7]，PDGFA基因与多种肿瘤密切相关。PDGFA基因的过表达能够促进诸如胶质母细胞瘤干细胞的自我更新和结直肠癌中的血管生成和肝转移。PDGFA基因还可能通过PDGF/AKT信号通路促进乳腺癌的发生与发展，或诱导间充质基质细胞对头颈部鳞癌肿瘤微环境的趋化作用等。故PDGFA有望成为这些肿瘤基因诊断和治疗的有效靶点。但是，目前关于PDGFA基因在鼻咽癌中的表达及作用较少见报道。 本文拟通过基因芯片数据分析PDGFA基因在鼻咽癌中的差异表达，并探索其详细功能和调控网络，为更深入理解鼻咽癌的发病机制、筛查发现易感基因和潜在基因治疗靶点等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 从美国国立生物技术信息中心(NCBI)的GEO数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)中检索鼻咽癌组织基因芯片表达谱。通过GEODataSets检索模式检索出符合条件的基因芯片数据集(GSE13597)，该数据集包含3个正常鼻咽黏膜组织样本和25个鼻咽癌组织样本。

1.2 方法

1.2.1 差异表达基因筛选 利用GEO数据库中的GEO2R在线分析工具，对系列数据(series)进行分析，以差异表达基因上调倍数(fold change，FC)的绝对值，即∣FC∣>2，错误发现率(false discovery rate，FDR)<0.05为标准，筛选出差异表达基因。查找PDGFA基因在鼻咽癌组织中的表达谱数据，下载并进行差异显著性分析。

1.2.2PDGFA及其相关基因的功能富集分析 使用STRING在线数据库(https：//string-db.org/)检索与PDGFA基因其编码蛋白存在互作关系的蛋白，筛选出PDGFA相关基因。经DAVID在线数据库(https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp)对PDGFA及相关基因进行功能富集分析，以FDR<0.05为有统计学意义。

1.2.3PDGFA参与的共表达调控网络分析以及转录因子预测 根据PDGFA基因在数据库中的注释情况，使用GCBI在线实验室(https：//www.gcbi.com.cn/gclib/html/index)对PDGFA基因与其他基因的共表达调控网络以及转录因子预测进行分析。

1.3 统计学方法 差异表达基因筛选，采用SPSS 14.0软件进行统计分析，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1PDGFA基因在鼻咽癌组织中的表达 GSE13597基因芯片数据集中，共筛选出包含PDGFA基因在内的790个基因，其中449个上调、341个下调(见图1)。PDGFA基因在鼻咽癌组织样本中高表达，其在4个正常鼻咽黏膜组织样本和14个鼻咽癌组织样本中的表达量情况见图2，其在两样本间的差异具有统计学意义(见图3)。

注：蓝色为显著下调表达基因，红色为显著上调表达基因。

注：图中柱形高度为PDGFA基因在各样本中的相对表达量。

注：横坐标为样本分组，纵坐标为PDGFA的相对表达量值。

2.2PDGFA及其相关基因的功能富集分析 经STRING在线数据库检索，共检索出20个与PDGFA基因其编码蛋白存在紧密互作关系的蛋白(见图4)。它们分别是PLCG1、KRAS、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、EGFR、PDGFB、CD247、HSPG2、SYK、GRB2、PDGFD、SHC1、HRAS、FGFR2、PDGFC、PIK3R1、NTRK1、AKT1和ITGB3。

图4 与PDGFA基因编码蛋白存在紧密互作关系的蛋白

该20个蛋白编码基因与PDGFA基因一起经DAVID数据库功能富集，结果发现它们主要参与了12个生物学过程(biological process，BP)、4个细胞组分(cellular component，CC)、3个分子功能(molecular function，MF)和11个信号通路(KEGG pathway，KEGG)，见图5。

2.3PDGFA基因的共表达调控网络 依据PDGFA基因在PubMed、MeSH、KEGG等数据库中与其他基因的关系，构建PDGFA基因的共表达调控网络(见图6)。可见，许多基因可作为PDGFA基因的下游基因，许多蛋白、microRNA也与PDGFA具有相互作用，激活和促进PDGFA。

2.4PDGFA基因的转录调控因子预测 依据Transfac数据库的预测分值和COSMIC数据库是否存在对应注释信息预测得出PDGFA基因的转录调控因子(见图7)。可见，许多因子可能作为PDGFA基因的上游转录调控因子，对PDGFA起转录调控作用。

3 讨论

肿瘤的生长是肿瘤细胞、基质细胞与局部微环境相互作用的结果。肿瘤细胞的黏附、侵入、定植、生长、转移等受到多种因素的影响。PDGF是平滑肌细胞、成纤维细胞和神经胶质细胞生长所必需的血清衍生组分[8]。前期多项研究发现[3-7]，PDGFA与多种肿瘤密切相关，肿瘤细胞分泌的PDGFA可以促进多种细胞的生长以及肿瘤细胞自身的黏附、生长与转移。此次，我们通过基因芯片数据分析发现PDGFA基因在正常鼻咽黏膜组织与鼻咽癌组织中亦有差异表达，并且PDGFA基因在鼻咽癌组织中明显上调。

注：BP：生物学程序；CC：细胞组分；MF：分子功能；KG：信号通络。

图6 PDGFA基因的共表达调控网络

图7 PDGFA基因的转录调控因子预测

分子表达有差异是探索分子功能的前提。于是，我们对PDGFA基因的功能、参与通路、与其它基因的共表达调控网络以及其转录因子预测等方面进行了分析。通过分析，我们发现PDGFA基因的分子功能和参与的生物学过程与细胞增殖正调控、细胞迁移的正调控、黏着、ERK1和ERK2级联的正调节、蛋白质自磷酸化的正调控等密切相关。富集到的许多通路，如MAPK信号通路[9]、Jak-STAT信号通路[10]、mTOR信号通路[11]等也都与癌症的发生发展相关。这进一步说明了PDGFA与肿瘤的密切程度。由此可见，PDGFA基因亦可能通过这些功能和途径对鼻咽癌的发生发展起重要作用。

PDGFA基因的共表达调控网络分析结果显示，许多基因如INSRR、TEK、NGFR、MET、KIT、KDR、INSR、IGF1R、FLTA、EPHA2、EGFR、CSF1R等都可以作为PDGFA基因的下游基因，与PDGFA发生作用，通过Ras信号通路、PI3K-Akt信号通路[12]、MAPK信号通路等多种通路参与各种代谢途径、调节细胞生长、信号转导等生命活动。另PDGF的受体基因——PDGFRB、PDGFRA也可以与PDGFA基因相互作用，参与调节肌动蛋白细胞骨架、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、间隙连接等。还有，许多转录因子对PDGFA基因也起重要的调控作用，如Sp1、Sp3和Egr-1可以对PDGFA正调控，GCF2、NF-1(X)和WT-1可以对PDGFA负调控，c-Ets-1通过与Sp1的协同作用，可促进PDGFA基因转录和血管平滑肌细胞生长[13]；一些蛋白，如SPARC、PDGFB、PDGFRA等也与PDGFA关联紧密，具有蛋白相互作用[14]。另外，从共表达调控网络图中，还可以看到PDGFA基因的转录调控还涉及非编码RNA的相互作用。许多microRNA，如miR-203a-5p、miR-1273g-6p、miR-7110-3p、miR-6817-3p、miR-130b-5p、miR-6873-3p、miR-4753-3p、miR-4768-5p可以靶向PDGFA，或被PDGFA诱导改变，这进一步揭示了PDGFA在参与癌细胞发生发展过程中还可能与PDGF受体信号的microRNA依赖性反馈机制有关[15]。

转录因子是控制基因表达的重要分子，直接控制基因表达的时间、地点和程度，激活或抑制基因转录。基于每个基因的转录本(Ensembl数据库注释)对起始位点上游2000bp、下游500bp通过Transfac数据库进行的转录因子预测结果，向我们展示了可能对PDGFA基因起调控作用的转录因子，如ZN451、ZFP532、ZBTB7B、ZBTB44、WT1、UF1H3BETA、SOX10、GABPA、AP2REP、BEN等。PDGFA基因的转录调控因子预测为我们今后继续探讨鼻咽癌的发病机制提供了一定方向。

综上所述，PDGFA在正常鼻咽黏膜组织与鼻咽癌组织中有差异表达。PDGFA与细胞的增殖、转移、信号转导等密切相关，其可能与microRNA、互作蛋白、下游基因、上游转录因子等相互作用，通过多种途径发挥功能，从而参与鼻咽癌的发生、发展与转移。