HPLC切换波长法测定益肾灵颗粒(无蔗糖)中特女贞苷、淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素的含量

方慧祥 崔庆德 吕 晋

云南省曲靖市食品药品检验检测中心，云南 曲靖 655000

益肾灵颗粒为中国药典[1]收载品种，由枸杞子、女贞子、附子(制)、芡实(炒)、车前子(炒)、补骨脂(炒)、覆盆子、五味子、桑椹、沙苑子、韭菜子(炒)、淫羊藿、金樱子十三味中药材组成。益肾灵颗粒具有温阳补肾之功效，用于肾气亏虚、阳气不足所致的阳痿、早泄、遗精或弱精症。淫羊藿和补骨脂均为方中君药，女贞子为方中臣药，现代药理研究表明，女贞子有促进生长[2]、增强体质[3]、强心[4]等作用；补骨脂有抗肿瘤[5]、抗骨质疏松[6]、抗氧化[7]等作用；淫羊藿有促进生殖[8]、提高免疫[9]、增加骨密度[10]、抗肿瘤[11]等作用。特女贞苷为女贞子的主要成分，具有调节免疫、抗氧化、抗衰老等作用，补骨脂素和异补骨脂素为补骨脂的主要成分，具有植物雌激素作用；淫羊藿苷为淫羊藿的主要成分，具有滋阴补阳、促进造骨细胞增殖等作用，中国药典[1]选择特女贞苷、补骨脂素和异补骨脂素、淫羊藿苷分别作为女贞子、补骨脂、淫羊藿三种药材的含量测定指标。有文献[12]报道HPLC法同时测定益肾灵颗粒中补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷的含量，但同时测定君药淫羊藿和补骨脂以及臣药女贞子中淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素和特女贞苷的含量未见报道。本实验参考中国药典[1]及相关文献[12-18]，建立HPLC切换波长法同时测定益肾灵颗粒(无蔗糖)中特女贞苷、补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷的含量方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津LC-20AT型高效液相色谱仪(配有LC-20AT型输液泵，CBM-20A型控制器， SIL-20A型自动进样器，CTO-10AS vp型柱温箱，SPD-20A型紫外检测器，DGU-20A5型脱气机，LCsolution色谱工作站)(日本岛津制作所)，XS105型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2 材料 特女贞苷对照品(批号:111926-201605，含量：93.3%)，补骨脂素对照品(批号:110739-201617，含量：99.7%)，异补骨脂素对照品(批号:110738-201614，含量：99.9%)，淫羊藿苷对照品(批号:110737-201516，含量：94.2%)，均购置于中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯(德国默克公司)；水为双蒸水；其余试剂均为分析纯；益肾灵颗粒(无蔗糖)(福建省泉州恒达制药有限公司，批号: 20150409、20160324、20160913)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：依利特 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温为30 ℃；流动相：甲醇(A) -乙腈(B)-水(C),梯度洗脱(25%A始终保持不变；0～35 min，7% B→19% B,35～50 min，19% B→19% B,50.01～60 min，7% B→7% B)；流速为1.0 mL·min-1； 检测波长：0～20 min，224 nm(特女贞苷)；20～35 min，246 nm(补骨脂素、异补骨脂素)；35～60 min，270 nm(淫羊藿苷)；进样量：10 μL。

2.2 样品制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取特女贞苷、淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素对照品22.78 mg、66.75 mg 、12.01 mg、12.64 mg置 50 mL 容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，得混合对照品储备液(质量浓度: 特女贞苷为0.4251 mg·mL-1，淫羊藿苷为 1.2576 mg·mL-1，补骨脂素为0.239 5 mg·mL-1，异补骨脂素为0.2525 mg·mL-1)，精密量取混合对照品储备液1 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品使用液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取益肾灵颗粒(无蔗糖)5袋，精密称定，研细，取约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，称定重量，置水浴上回流1 h，放冷，再称定重量，用60%乙醇补足减少的重量，摇匀，静置，取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方比例及工艺，分别制得缺女贞子、缺补骨脂、缺淫羊藿的阴性对照，按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 分别精密量取“2.2.1”项下的混合对照品储备液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL, 分别置25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得。分别进样10 μL，记录峰面积。以进样量(x,μg)为横坐标,峰面积(y)为纵坐标,进行线性回归,分别得特女贞苷、补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷回归方程为y=1268121.8x+250.4，r=0.9997(n=7);y=7680626.9x+1180.9，r=0.9999(n=7);y=7581018.9x+4347.4，r=0.9999(n=7);和y=2297168.2x+1699.7，r=1.0000(n=7)。结果表明，特女贞苷、补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷的进样量分别在0.03401～0.8501 μg、0.01916～0.4790 μg、0.02020～0.5051 μg、和0.1006～2.5151 μg的范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系。混合对照品、供试品及阴性对照的色谱图如图1所示。

2.3.2 精密度试验 精密吸取“2.2.2”项下经0.45 μm的微孔滤膜滤过的供试品溶液10 μL，连续进样6次，记录峰面积。结果，特女贞苷、补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷峰面积的RSD分别为0.74%、0.56%、0.58%和0.43%。表明仪器精密度良好。

2.3.3 空白试验 吸取“2.2.3”项下的阴性对照溶液，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，结果显示，阴性对照在与对照品和供试品色谱峰保留时间相应位置上，没有相应的色谱峰，表明阴性对照不干扰测定。

2.3.4 重复性试验 取同一批样品(批号：20160324)6份，按“2.2.2”项下制备，测定特女贞苷、补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷的含量，其含量的RSD分别为0.75%、0.86%、0.79%和0.60%，表明方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取“2.2.2”项下制备好的同一份样品，分别在0、2、4、8、16、24、36 h进样10 μL，记录峰面积。结果，特女贞苷、补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷峰面积的RSD分别为0.96%、0.69%、0.73%和0.55%，表明样品在36 h内稳定。

2.3.6 加样回收率试验 取已知含量的益肾灵颗粒(无蔗糖)(批号：20160324)6份，每份约3 g，精密称定，精密加入“2.2.1”项下的混合对照品储备液1 mL，再精密加入60%乙醇49 mL，按“2.2.2”项下操作。测得加样回收率见表1。

2.3.7 样品测定结果 分别取3批益肾灵颗粒(无蔗糖)，按“2.2.2”项下的方法操作，测定含量。结果见表2。

表1 加样回收率试验结果 (n=6)

续表1

表2 样品含量测定结果 (mg/g， n=3)

3 讨论

3.1 提取方法的选择 参考中国药典[1]及相关文献[12-15]，以提取溶剂(甲醇和乙醇)、提取溶剂浓度(40%、60%、80%、100%)、提取方法(超声和回流)、提取时间(20 min、40 min、60 min、80 min)为试验因素进行正交试验，发现用60%的乙醇回流提取1 h效果最好。从而确定用60%的乙醇回流提取1 h为本试验的提取方法。

3.2 检测波长的选择 分别取特女贞苷、补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷对照品溶液在200～500 nm范围内进行紫外扫描，特女贞苷、补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷分别在224 nm、246 nm、246 nm和270 nm处有最大吸收。为简化方法，参考中国药典[1]及文献[12-13,17-18]使用的检测波长，进行单波长同时检测以上四个成分，当用224 nm波长时，补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷响应值偏低，当用246 nm时，特女贞苷和淫羊藿苷响应值偏低，当用270 nm时，特女贞苷、补骨脂素和异补骨脂素响应值偏低，不利于定量测定，故最终定为切换波长法进行测定。

3.3 流动相的选择 曾尝试用甲醇-水系统或乙腈-水系统进行分离，当采用甲醇-水系统时异补骨脂素的保留时间与淫羊藿苷的保留时间相差太远，浪费分析时间，当采用乙腈-水系统时异补骨脂素的保留时间与淫羊藿苷的保留时间相差太近，不利于切换波长，最后采用甲醇-乙腈-水系统得到良好效果，因此本试实验最终将流动相甲醇-乙腈-水进行梯度洗脱。

现代医学研究[19-20]发现，益肾灵颗粒对改善少、弱精男性的精液质量有较好的临床疗效。益肾灵颗粒中淫羊藿为补肾壮阳之要药，具有补肾阳的功效，补骨脂具有温肾助阳的功效，女贞子具有滋补肝肾的功效。中成药的临床疗效是来自组方中各味中药的综合作用，为保证临床疗效，同时控制多味中药质量显得尤为重要。本方法能同时测定益肾灵颗粒(无蔗糖)中特女贞苷、补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷的含量，对保证益肾灵颗粒临床疗效发挥积极作用。