铁甲草中齐墩果酸的含量测定

赵 莹 叶小玲 苏璐丹 翟 明 张声源,3 聂 华,3*

1.嘉应学院医学院客家药用生物资源研究所，广东 梅州 514031；2.江门市蓬江区中西医结合医院，广东 江门 529030；3.嘉应学院广东省山区特色农业资源保护与精准利用重点实验室，广东 梅州 514031

铁甲草(CassiamimosoidesLinn.)为豆科(Leguminousae)决明属一年或多年生亚灌木状草本植物，以全草入药，主要分布于广东、福建、云南、台湾、贵州和广西等地，其味甘、性平，具有清肝明目、散瘀化积的功效[1]。有研究结果表明，铁甲草能够有效抑制脂肪酶，防止脂肪肝[2-3];其主要化学成分有大黄素、齐墩果酸、β-谷甾醇、木犀草素、槲皮素等[4-5]。然而，目前国内外对铁甲草的研究主要集中在化学成分和药理作用方面，有关铁甲草药材质量控制的研究很少，且未见对其有效成分进行含量测定的报道。本实验以铁甲草中具有抗炎保肝的有效成分齐墩果酸[6]，作为定量检测指标成分，建立铁甲草中齐墩果酸的HPLC含量测定方法，为铁甲草的质量控制和合理开发提供参考依据。

1 仪器与材料

Waters Alliance 2695型高效液相色谱仪(Waters公司)； Waters XBridge Peptide BEH C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)； WJX-A1000型高速多功能粉碎机(浙江省永康市红太阳机电有限公司)；JP-100S型超声波清洗器(深圳市洁盟清洗设备有限公司)；MING-CHE 24UV超纯水机(法国Merck Millipore公司)。

齐墩果酸对照品(批号：C1723001)，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；铁甲草采于广东省梅州市蕉岭县，经嘉应学院医学院生药学翟明老师鉴定为豆科决明属植物铁甲草(Cassiamimosoides)的全草；其他试剂均为分析纯。

2 方法及结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酸对照品1 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，即得。

2.2 供试品溶液的制备 称取铁甲草粗粉2 g，加入2 moL/L的盐酸10 mL，充分浸润后，在60 ℃水浴下，酸水解2 h，滤渣用超纯水水洗至中性，干燥后加入10倍量的90%的乙醇溶液和0.5%NaOH溶液，调节pH值至8，50 ℃超声30 min，抽滤后，水浴加热浓缩成浸膏。

浸膏用甲醇超声溶解后，离心取上清液，定容至10 mL，即得。

2.3 色谱条件 色谱柱：Waters XBridge Peptide BEH C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：甲醇：PBS=85∶15；检测波长：210 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL，柱温：35 ℃。

2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.1”项下的齐墩果酸对照品0.5、1、2、3、4、5 mL溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得浓度为5、10、20、30、40、50 μg/mL系列浓度的齐墩果酸对照品溶液，于“2.3”项下的色谱条件，以齐墩果酸对照品溶液色谱峰面积Y为纵坐标，齐墩果酸对照品浓度X(μg/mL)为横坐标，进行线性拟合，得齐墩果酸标准曲线，求得回归方程Y=4533X+909.6，R=0.9996。结果表明，在5～50 μg/mL的浓度范围内，齐墩果酸对照品溶液的峰面积与浓度的线性关系良好。

2.5 专属性考察 取项目“2.1”和“2.2”项所制备的对照品溶液和供试品溶液，在“2.3”的色谱条件下进样，齐墩果酸的保留时间约为13.77 min，峰型稳定，分离度良好，有较好的基线分离，未见杂质峰干扰，具有良好的专属性。如图1所示。

2.6 仪器精密度试验 精密吸取对照品溶液1.0 mL，于“2.3”项的色谱条件下，连续重复进样6次，每次10 μL，检测得到大黄素峰面积的RSD为1.36%,表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 精密吸取供试品溶液1.0 mL，分别于0、2、4、6、8、12 h于“2.3”项色谱条件下进样，检测得到齐墩果酸的峰面积的RSD为0.82 %。表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.8 重复性试验 精密称取6份等质量铁甲草粗粉2.00 g，按“2.2”项下的方法平行制备6份供试品溶液，于“2.3”项的色谱条件，检测得到齐墩果酸峰面积的RSD为1.47 %。表明该方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的等质量铁甲草粗粉6份，每份2.00 g，分别精密加入同一浓度的齐墩果酸对照品，按上述“2.2”的提取方法平行制备成供试品溶液，于“2.3”项色谱条件下测定，计算得到平均回收率结果为99.39%，RSD为1.53%。表明该方法测得的结果有良好准确性。结果见表1。

表1 加样回收率试验测定结果 (n=6)

2.10 样品含量测定 精密称取3份不同批药材各2.00 g，按照“2.2”项的制备方法制备成供试品溶液，每份样品分别在“2.3”项的色谱条件下进样三次，记录峰面积，计算样品中齐墩果酸的含量。结果见表2。

表2 铁甲草中大黄素和齐墩果酸含量测定结果 (n=3)

3 讨论

在考察齐墩果酸的色谱条件时，曾采用甲醇水，甲醇-0.1%甲酸和甲醇-PBS作为流动相，考察结果显示，当流动相选择为甲醇-PBS(85∶15)时，样品中齐墩果酸分离度更好，峰型稳定，无杂峰干扰。由于齐墩果酸同时含有羟基和羧基基团，在碱性条件下更易被提取，在提取条件的考察过程中，发现加入适量碱溶液使其pH值至8时，更利于齐墩果酸成分的提取。

本实验建立应用高效液相色谱法测定铁甲草中齐墩果酸含量的方法，方法精密度高、稳定性、重复性、加样回收率均符合方法学验证的要求。测得3批样品中，齐墩果酸的含量在3.67% ～3.73%之间，含量较高，且齐墩果酸在临床上主要用于护肝降酶，与铁甲草的功效相符，说明齐墩果酸适合作为铁甲草的质量检测指标成分，该方法可作为铁甲草质量控制的方法，从而为铁甲草质量标准的制订提供参考依据。