双黄连口服液对豚鼠宫内感染巨细胞病毒致子代脑损伤的影响

姚 远，谢集建，刘彩霞

(十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)，湖北 十堰 442000)

宫内感染是指孕妇在妊娠期间胎盘或下生殖道致病微生物的逆行扩散导致胎儿的宫内感染，又称先天性感染或母婴传播疾病，在产前或产后对新生儿生长发育均产生不良影响，是引起新生儿脑损伤的重要因素[1-2]。宫内感染对胎儿的影响与致病微生物的种类、感染时孕妇的免疫状态、胎龄等均有关。因妊娠早期胎儿器官发育较为敏感，故孕早期宫内感染导致新生儿生长发育障碍、特别是脑损伤最为严重[3]。流行病学研究显示，人巨细胞病毒(HCMV)感染占孕妇原发感染的1%～4%，24%～75%HCMV感染者可发生母婴垂直传播，是导致流产、早产及子代发育畸形、小头、癫痫、失明、耳聋、智力障碍甚至死亡的重要病因，而实施早期感染控制措施可显著改善妊娠结局和子代预后[4]。故筛选一种有效的抗HCMV感染药物用于防治宫内感染有重要意义。双黄连口服液为临床常用中成药，主要由黄芩、连翘和金银花的提取物精制而成，具有清热解毒、疏风解表之功效及抗炎、抗病毒等作用[5]。动物研究发现，双黄连口服液可降低HCMV感染小鼠肝组织中HCMV-DNA载量，能明显减轻HCMV感染引起的急性原发小鼠肺部炎症损害并降低小鼠肺组织中HCMV-DNA载量，还具有抑制HCMV复制、减轻感染小鼠内耳炎症损害而改善小鼠听力的作用[6-8]。但双黄连口服液对宫内感染HCMV是否有影响尚不明确，因此，本研究通过建立豚鼠巨细胞病毒(GPCMV)宫内感染模型，观察了双黄连口服液干预后孕鼠的妊娠结局及子代脑损伤情况，旨在为筛选抗HCMV宫内感染药物提供实验依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级Hartley豚鼠，雌40只，雄10只，3月龄，体质量(325±15)g，购自广东省医学实验动物中心[许可证号：SYXK(鄂)2019-0031]，饲养于十堰市太和医院动物实验中心SPF级动物房。实验期间保证动物福利[湖北医药学院动(福)第2017-59号]，动物自由饮水、勤换垫料保持卫生，喂养普通饲料。动物房温度设定在(21±2)℃。

1.2仪器与试剂 双黄连口服液(哈药集团三精制药股份有限公司生产，批号：20180409)； GPCMV毒株由湖北省病毒研究所提供；听觉脑干诱发电位仪(上海名元实业有限公司，型号：NTS-2000)；水合氯醛(上海信裕生物科技有限公司，批号：20180409)；乙酰胆碱(Ach)、乙酰胆碱酯酶(AchE)ELISA检测试剂盒由南京金益柏生物科技有限公司提供(批号:L038，L1207)。

1.3实验方法 实验前豚鼠适应性饲养1周，白夜自然交替光照。1周后于18:30开始配种，豚鼠按雌雄4∶1合笼，过夜后于第2天8：00检测雌鼠是否授精。判断方法：取雌鼠阴道分泌物，涂片，于显微镜下观察，以见到精子为受孕 0 d。然后选出其中的30只孕鼠，随机分为正常组、GPCMV组和双黄连组，每组10只。将GPCMV毒株按常规方法培养传代，病毒滴度为106～107，50%组织培养感染量为TCID50/0.1 mL。于孕早期 (孕20 d)，GPCMV组和双黄连组豚鼠腹腔接种1 mL GPCMV(107TCID50)/只，正常组仅腹腔注射1 mL生理盐水。双黄连组接种同时灌胃双黄连口服液2 mL/kg，GPCMV组和正常组给予生理盐水2 mL/kg灌胃，1次/d，均连续灌胃21 d。

1.4观察指标

1.4.1孕鼠一般情况及仔鼠生长发育情况 观察孕鼠接种后行为、体质量、进食及睡眠等情况。豚鼠孕期较长，约为63(59～72)d，每鼠可产仔鼠1～4只。以59 d(含59 d)前出生的为早产仔鼠，观察各组早产仔鼠及正常分娩仔鼠生长发育情况。

1.4.2静脉血GPCMV-DNA载量 仔鼠于出生后第35天，每组随机取10只，采用 RT-PCR法检测静脉血GPCMV-DNA载量。检测时取静脉血50 μL，准确加入10 μL DNase，混匀，37 ℃消化16 h后用乙戊醇抽提GPCMV-DNA。引物序列：上游引物为5’-AATAG AA CCTATG CCTCA G-3’，下游引物为5’-GAATACCC GTA ATCGTAAG -3’，扩增片段长231 bp，2%琼脂糖凝胶电泳判断GPCMV-DNA载量。

1.4.3静脉血Ach水平和AchE活性 取出生后第35天仔鼠静脉血0.1 mL，采用ELISA法、参考试剂盒说明书检测Ach水平和AchE活性。

1.4.4脑干听觉诱发电位(BAEP) 参考文献[9]方法对出生后第35天仔鼠进行检测，检测前腹腔注射10%水合氯醛，使动物进入深睡眠，接NTS-2000肌电图与听觉脑干诱发电位仪检测BAEP。地线粘于仔鼠后肢裸露部位、记录电极用4.5号针头插入仔鼠头顶部中央区，参考电极置于双耳后乳突处，用听力学耳机给予动物单耳滤波短声刺激，对侧耳给予白噪声遮蔽，参数设置：刺激频率11 Hz，脉冲宽100 ms，刺激强度60 dB，带通范围100～2 000 Hz，分析时间10 ms，平均叠加996次，每耳测试3次取均值。

2 结 果

2.1各组孕鼠一般情况及仔鼠生长发育情况 正常组孕鼠体质量增长正常，均无早产，存活仔鼠36只，出生时体质量(94.69±1.73)g。 GPCMV组孕鼠接种GPCMV后全部感染，7 d后均出现病毒血症的表现，表现为躁动、被毛耸立、嗜咬笼架、少食多睡现象，体质量至产仔时不增或少增等，有3只孕鼠体质量甚至下降，接种17 d后死亡1只；4只孕鼠早产；存活仔鼠15只，出生时体质量(78.70±3.99)g，均感染GPCMV。双黄连组孕鼠GPCMV感染率为80%(8/10)，病毒血症的表现较GPCMV组轻，孕鼠无死亡；2只孕鼠早产；存活仔鼠19只，出生时体质量(85.56±4.47)g，13只(68.4%)感染GPCMV。GPCMV组和双黄连组存活仔鼠均明显少于正常组(P均<0.05)，仔鼠体质量均明显低于正常组(P均<0.05)。双黄连组孕鼠GPCMV感染率、早产孕鼠率及仔鼠GPCMV感染率均明显低于GPCMV组(P均<0.05)，存活仔鼠数和仔鼠体质量明显高于GPCMV组(P均<0.05)。

2.2各组静脉血GPCMV-DNA载量及Ach水平、AchE活性比较 GPCMV组静脉血GPCMV-DNA载量和AchE活性均明显高于正常组(P均<0.05)，Ach水平明显低于正常组(P<0.05)；双黄连组静脉血GPCMV-DNA载量和AchE活性均明显低于GPCMV组(P均<0.05)，Ach水平明显高于GPCMV组(P<0.05)。见表1。

表1 各组仔鼠静脉血GPCMV-DNA载量及Ach水平、AchE活性比较

2.3各组BAEP测试结果比较 GPCMV组仔鼠Ⅲ波、Ⅴ波潜伏期和Ⅲ～Ⅴ波、Ⅰ～Ⅴ波峰间期均明显长于正常组(P均<0.05)，Ⅲ波、Ⅴ波波幅均明显高于正常组(P均<0.05)。双黄连组仔鼠Ⅲ波、Ⅴ波潜伏期和Ⅲ～Ⅴ波、Ⅰ～Ⅴ波峰间期均明显短于GPCMV组(P均<0.05)，Ⅲ波、Ⅴ波波幅均明显低于GPCMV组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组仔鼠BAEP测试结果比较

3 讨 论

宫内感染是造成子代脑损伤的主要致病因素，其中又以缺氧缺血性脑病为多见，也是导致子代死亡和后遗症的重要病因之一[10-11]。缺氧缺血性脑病的发生多与宫内病毒感染后胎儿脑局部血流减少或暂停有关，胎儿脑组织会因缺氧导致继发性脑损伤[12]。宫内感染引起的缺氧缺血性脑损伤也是导致海马神经元凋亡的主要原因[13]，海马神经元凋亡会造成树突轴突发育不良，神经元数量减少，还可直接造成突触生成受阻和功能性修饰障碍，从而影响子代近期及远期的学习记忆功能[14]。在学习和记忆过程中，海马神经元负责各种信号传递，在这一过程中，胆碱能纤维突触释放神经递质Ach，而Ach传导的信号与认知、学习记忆功能关系密切，记忆能力的强弱主要决定于胆碱能纤维是否丰富和Ach水平[15]。AchE为水解突触上Ach的酶，二者处于动态平衡。AchE活性过高会水解突触上的Ach，而Ach过多消耗会造成中枢神经损伤，导致认知、学习记忆功能下降，提高海马组织Ach水平可增强学习和记忆功能[16-17]。因此控制早期宫内感染，抑制AchE活性可间接增加Ach，这有利于减轻脑损伤，促进子代近期及远期智力发育。

由于GPCMV感染具有动物种族易感性，且可经胎盘垂直传播，感染后的表现与HCMV感染极为接近，故目前在相关研究中多采用GPCMV宫内感染模型来探讨HCMV宫内感染机制[18]。本实验亦选择此模型进行研究，结果显示双黄连组孕鼠GPCMV感染率、早产孕鼠率、仔鼠GPCMV感染率、仔鼠静脉血GPCMV-DNA载量均明显低于GPCMV组，存活仔鼠数、仔鼠体质量均明显高于GPCMV组。提示双黄连口服液不但可降低孕鼠GPCMV感染率，还可抑制子代感染。由于Ach主要在脑胆碱能纤维突触上合成和释放，故检测子代Ach水平可一定程度上反映其近期和远期智力发育情况。本实验中双黄连组仔鼠静脉血AchE活性明显低于GPCMV组， Ach水平明显高于GPCMV组，提示双黄连口服液通过抑制AchE活性而间接降低AChE对Ach的水解作用，使Ach水平提高，这有利于改善子代因宫内感染GPCMV而造成的脑损伤。

BAEP检测是记录声刺激引起的神经冲动在脑干听觉传导通路上的电活动的重要方法， 所记录到的电位活动能客观反映听神经到丘脑水平听觉神经系统功能，是判断脑干及听觉传导通路是否受损的敏感指标，其不仅可早期、准确地诊断中枢神经系统病变，判断听力损伤程度，还可对损伤部位进行定位，为评估脑干和大脑损伤的重要指标[19-21]。一般情况下，听神经损伤时Ⅲ波、Ⅴ波波幅异常升高，Ⅲ波、Ⅴ波潜伏期和Ⅲ～Ⅴ波、Ⅰ～Ⅴ波峰间期会异常延长，这在本实验GPCMV组得以体现，说明造模是成功的。而双黄连组仔鼠Ⅲ波、Ⅴ波潜伏期和Ⅲ～Ⅴ波、Ⅰ～Ⅴ波峰间期均明显短于GPCMV组，Ⅲ波、Ⅴ波波幅明显低于GPCMV组，说明双黄口服液可以改善仔鼠听神经发育，遏制听力损伤。

综上所述，双黄连口服液早期干预可抑制GPCMV引起宫内感染，降低早产率及正常分娩的子代鼠因GPCMV感染而导致脑损伤的风险，可能与双黄连口服液可抑制GPCMV复制，阻止病毒母婴垂直传播，降低GPCMV-DNA载量，抑制AchE活性，从而减弱对子代神经发育的影响有关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。