酶标羊抗兔聚合物中加入不同表面活性剂对免疫组化染色强度的影响

陈 玲，梁永波，李 莉，刘玲玲，齐 华

在临床病理诊断和形态学研究中，免疫组化是病理科主要的辅助诊断技术之一，对疾病诊断、预后判断、靶向治疗相关指标的检测指导临床用药、了解发病机制和检测病原体等方面起重要的作用[1-2]。免疫组化整体染色步骤繁琐，每一步骤所用试剂及操作方法均可能影响染色效果，本文主要探索向酶标羊抗兔聚合物中添加不同表面活性剂对免疫组化染色强度的影响，以期筛选出对免疫组化染色效果具有正向作用的辅助试剂。

1 材料与方法

1.1 实验材料组织蜡块来自于赛诺特医学检验所，3 μm厚切片。

1.2 试剂Tris-EDTA抗原修复液(pH 9.0)，抗体p40(克隆号ZR8)，CK5(克隆号C9E33)，内源性过氧化物酶阻断剂，分别含0.2%Saponin、0.2%Tritoon-100和0.2%Nonidet P-40的酶标羊抗兔(Microstacker)聚合物，以上试剂来自河南赛诺特公司EnVision检测系统及DAB免疫显色剂(Dako公司)；以上所有试剂均为即用型。辅助试剂：75%、85%、95%和100%乙醇；透明试剂二甲苯；封片胶等。

1.3 实验步骤(1)常规免疫组化脱蜡至水。(2)使用高压锅抗原修复法修复；待锅中液体自然冷却至室温后取出切片，蒸馏水浸泡5 min×2次，使用免疫组化油笔对待测组织进行画圈，将待测组织全部包含在圈内。(3)加过氧化物酶封闭剂，室温孵育5 min，置于PBS清洗液5 min×2次。(4)一抗孵育：室温60 min，置于PBS清洗液5 min×2次。(5)二抗孵育：室温30 min(含 Nonidet P-40、Saponin、Trition-100的酶标羊抗兔聚合物和Dako公司EnVision检测系统HRP，置于PBS清洗液5 min×2次。(6)显色，滴加100 μL DAB显色液，孵育5 min，纯化水冲洗；(注意：显色液需要现配现用)。(7)复染：苏木精复染液孵育5 min，再用纯化水冲洗并浸泡5 min。(8)梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封固。

2 结果

在酶标羊抗兔聚合物中分别加入0.2%Saponin、0.2%Trition-100和0.2%Nonidet P-40三种表面活性剂，发现含Saponin和Trition-100的实验处理在p40(胞核)项目中能够增强染色，而含Nonidet P-40的实验处理却使p40(胞核)染色强度减弱，但对CK5(胞质)的染色强度未表现出明显差异性(图1)。

图1 p40为同一肺组织石蜡切片，Nonidet P-40组染色强度减弱，CK5为同一子宫颈组织石蜡切片，各组染色强度一致

3 讨论

准确的病理诊断依赖于可靠的技术支撑，因此对免疫组化技术的质量控制至关重要，实验过程中不仅需要选择合适的抗原修复液及修复方式，过硬的抗体及酶标抗体的质量来确保免疫组化染色质量[3-5]，同时也希望通过添加一些辅助试剂来提高免疫组化染色强度及背景清晰度，为病理医师的诊断提供方便。本文通过向酶标羊抗兔聚合物中添加不同种类的表面活性剂，实验结果显示添加Saponin或Trition-100表面活性剂染色p40(胞核)能够增强染色强度，而添加Nonidet P-40则使p40染色强度减弱，但是对CK5(胞质)染色差异均无显著性。分析原因可能是由于Saponin茶皂素是一种纯天然非离子型表面活性剂，Trition-100是一种黄色黏稠状液体的表面活性剂；Saponin茶皂素和Trition-100均能够溶解脂质，增加细胞通透性，进而有利于抗体渗入到细胞核内与相应的抗原结合导致核表达的阳性细胞数量增加染色强度增强；但是对细胞膜/细胞质的着色并无明显差异[6]。Nonidet P-40是一种无离子去垢剂，与蛋白结合能力强，可与细胞膜上的蛋白结合阻碍抗体顺利渗入细胞核内与相应的抗原结合而减弱核表达强度，同样对细胞膜、细胞质上未表现出明显强度差异。