RASSF7表达与乳腺癌上皮-间质转化的关系

韩艳春，荆丽丽，石佳宁，朱昊翔，李宗睿，尚丹丹，王 希

近年乳腺癌已成为我国女性发病位居首位的恶性肿瘤，部分患者常因发生浸润和转移而死亡，深入了解乳腺癌的转移机制，才有可能实现乳腺癌的真正治愈[1]。已有研究表明，上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在上皮性肿瘤细胞的侵袭、转移过程中发挥关键作用。因此，研究EMT发生过程的关键因子，探讨EMT发生机制对于乳腺癌侵袭和转移的防治具有重要意义。RASSF7是Ras相关结构域家族(ras-association domain family, RASSF)的重要成员之一，与调节细胞死亡和增殖等重要的生物学进程有关，在一些肿瘤组织中呈高表达，并可能促进肿瘤的形成。在缺氧诱导乳腺癌MCF-7细胞mRNA表达谱中研究发现存在RASSF7基因高表达[2]。然而，关于RASSF7在乳腺癌中的表达及其生物学功能研究较少。因此，本实验初步探讨RASSF7在乳腺癌中的表达及作用。

1 材料与方法

1.1 材料收集2015～2017年滨州医学院烟台附属医院病理科存档的80对乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织标本。所有患者均为女性，均行手术切除术，术前未行放、化疗等治疗；组织学分级：Ⅰ级30例，Ⅱ级35例，Ⅲ级15例；TNM分期：Ⅰ期29例，Ⅱ期40例，Ⅲ期11例。无腋窝淋巴结转移者39例；发生同侧腋窝淋巴结转移者41例。8对新鲜乳腺癌及癌旁正常乳腺组织标本手术切除后立即存放于-80 ℃超低温冰箱中备用。

1.2 试剂乳腺癌MDA-MB-231细胞系购于上海细胞库。细胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养，置于37 ℃、5%CO2培养箱中传代培养。取对数生长期乳腺癌细胞待贴壁后分为正常氧对照组、缺氧组(加入终浓度为200 μmol/L CoCl2)培养48 h。

兔抗人RASSF7、HIF-1α抗体购于武汉三鹰生物公司；兔抗人E-cadherin、vimentin、N-cadherin抗体购于北京博奥森生物公司；鼠抗人单克隆GAPDH抗体购于北京中杉金桥公司；ECL发光试剂购于Thermo公司；免疫组化检测试剂盒、DAB试剂盒均购于北京中杉金桥生物公司。

1.3 方法

1.3.1免疫组化 乳腺癌及癌旁正常乳腺组织蜡块标本均制成4 μm厚切片，免疫组化染色采用EnVision法。一抗包括RASSF7(稀释度1 ∶200)、HIF-1α(稀释度1 ∶300)、E-cadherin(稀释度1 ∶300)、vimentin(稀释度1 ∶300)、N-cadherin(稀释度1 ∶300)，4 ℃孵育过夜。用已知阳性染色的乳腺癌组织切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

结果判定：RASSF7阳性主要定位于细胞质，HIF-1α阳性主要定位于细胞核，少量定位于细胞质。按染色细胞比例划分为五个等级：无阳性细胞为0分，阳性细胞数占1%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分；按染色强弱则划分为四个等级：未着色为0分，淡黄色为1分，黄色或棕黄色为2分，棕褐色为3分。两项得分结果相乘得分≥2定为RASSF7和HIF-1α阳性。E-cadherin阳性定位于细胞膜，>50%的细胞染为棕黄色颗粒为阳性；N-cadherin阳性定位于细胞膜和(或)细胞质，>10%的细胞染为棕黄色颗粒为阳性；vimentin阳性主要定位于细胞质，>10%的细胞染为棕黄色颗粒为阳性。

1.3.2Western blot法 于-80 ℃超低温冰箱中备用的乳腺癌及癌旁正常乳腺组织中加入RIPA裂解液，进行组织蛋白提取，蛋白浓度测定采用BCA法。上样总蛋白为60 μg，于10%的SDS-PAGE中电泳，电泳结束后将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜，室温5%脱脂奶粉封闭2 h，分别用一抗RASSF7、HIF-1α、E-cadherin、vimentin、N-cadherin(抗体终浓度均为1 ∶500)进行4 ℃孵育过夜。次日，用以辣根过氧化物酶标记的相应二抗(稀释度1 ∶1 500)室温孵育1.5 h，用ECL发光并拍照。以GAPDH(稀释度1 ∶1 500)作为内参对照。

1.4 统计学分析采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，采用Chi-Square检验分析RASSF7表达与乳腺癌临床病理特征的关系，用Pearson相关检验分析RASSF7表达与HIF-1α、E-cadherin、vimentin、N-cadherin表达的相关性，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌和癌旁正常乳腺组织中RASSF7的表达免疫组化结果显示，乳腺癌组织中RASSF7表达主要定位于细胞质(图1)。乳腺癌组织中RASSF7的阳性率为70.0%(56/80)，明显高于癌旁正常乳腺组织(27.5%，22/80)，差异有显著性(P<0.05)。Western blot法结果亦证实，乳腺癌组织中RASSF7蛋白表达高于癌旁正常乳腺组织(图2)。

图1 A.乳腺癌中RASSF7呈阳性，EnVision法；B.癌旁正常乳腺组织中RASSF7呈阴性，EnVision法

图2 Western blot法检测RASSF7在乳腺癌和癌旁正常乳腺组织中的表达：T.乳腺癌组织；N.癌旁正常乳腺组织

2.2 RASSF7表达与乳腺癌临床病理特征的关系有淋巴结转移的乳腺癌组织中RASSF7阳性率明显高于无淋巴结转移者(P=0.002)，TNM高分期的乳腺癌组织中RASFF7阳性率明显高于TNM低分期者(P=0.027)。RASSF7表达与乳腺癌患者年龄、肿块直径、肿瘤组织学分级无相关性(P>0.05，表1)。

2.3 不同氧环境下，HIF-1α、RASSF7及EMT标志蛋白表达水平变化分别比较常氧和低氧条件下培养48 h后，MDA-MB-231细胞中EMT标志蛋白表达水平变化。Western blot法检测结果证实，低氧环境下，MDA-MB-231细胞中上皮标志蛋白E-cadherin表达显著降低，间质相关蛋白N-cadherin和vimentin表达显著上升，HIF-1α和RASSF7表达均显著上调(图3)。

2.4 乳腺癌组织中RASSF7与HIF-1α、EMT标志蛋白表达之间的关系Pearson相关检验显示，乳腺癌组织中RASSF7与HIF-1α表达呈正相关(r=0.245，P=0.029)，RASSF7与E-cadherin表达呈负相关(r=-0.33，P=0.003)，与vimentin(r=0.237，P=0.034)和N-cadherin(r=0.301，P=0.007)表达呈正相关(表2)。

表1 RASSF7表达与乳腺癌临床病理特征的关系[n(%)]

图3 低氧条件下MDA-MB-231细胞中HIF-1α、RASSF7及EMT标志蛋白表达变化

表2 乳腺癌中RASSF7表达与HIF-1α、E-cadherin、vimentin、N-cadherin表达的关系[n(%)]

3 讨论

近来研究结果表明，乳腺癌细胞的EMT是其发生侵袭、转移的主要原因。EMT是具有极性的上皮细胞与基膜作用后上皮细胞极性消失，获得间质细胞表型的过程[3-4]。通过EMT过程，乳腺癌细胞能够获得更强的侵袭能力，穿过细胞外基质和血管基膜从而进入循环系统，进而形成远处转移灶，这是乳腺癌转移的关键步骤。但目前关于乳腺癌EMT的机制尚不明确，需深入探究。

HIF-1α是肿瘤细胞缺氧的重要标志物之一，已有文献报道调控细胞内HIF-1α的表达水平可影响其EMT的发生。乳腺癌细胞处于缺氧环境下，HIF-1α表达增加，通过一系列信号通路介导下调E-cadherin的表达，使乳腺癌细胞间连接变疏松，向周围组织侵袭性生长，导致远处器官转移[5]。本组实验结果证实，低氧环境下，MDA-MB-231细胞中上皮标志蛋白E-cadherin表达显著降低，间质相关蛋白N-cadherin和vimentin表达显著上升。以上结果提示低氧环境可能与乳腺癌的EMT表型改变有关。

现有实验已证实低氧环境下MDA-MB-231细胞发生EMT表型改变，后续进一步探讨低氧诱导乳腺癌EMT的可能机制。相关研究结果表明RASSF7与调控细胞死亡和增殖等重要生物学进程有关。有报道指出RASSF7在胰腺癌、子宫内膜癌、卵巢透明细胞癌中的表达水平上调，且在肿瘤组织中的表达比正常组织高近百倍，认为RASSF7可能促进癌症的形成[6]。本组实验结果表明，RASSF7在乳腺癌组织中呈高表达。最近有研究表明，在低氧条件下人类细胞系中RASSF7蛋白表达上调[7]。本组实验结果表明，在乳腺癌组织中RASSF7与HIF-1α表达呈正相关，且在低氧环境下MDA-MB-231细胞中HIF-1α和RASSF7表达均显著上调。提示HIF-1α和RASSF7可能与低氧诱导乳腺癌EMT有关。

Wang等[8]报道DSC1与RASSF7结合并通过RAS/MEK/ERK信号通路调节胚胎脑中的星型胶质细胞形成。Zhang等[9]报道RASSF7通过激活MEK1/2-ERK1/2信号通路促进肝细胞癌细胞增殖。ERK等信号通路通过调节其下游转录因子活性而抑制E-cadherin的表达，进而促进EMT的发生。Zheng等[10]发现转染RASSF7质粒后可以明显提高Hippo通路转录子TEAD的转录活性促进非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭。本组实验结果发现，低氧环境下乳腺癌细胞中RASSF7表达明显增加，vimentin和N-cadherin呈高表达，E-cadherin呈低表达。且乳腺癌组织中RASSF7与E-cadherin表达呈负相关，与N-cadherin和vimentin表达呈正相关，其表达与乳腺癌淋巴结转移和TNM分期呈正相关。以上结果提示缺氧诱导RASSF7表达增加，RASSF7与乳腺癌的EMT表型有关，RASSF7可能通过下调E-cadherin，上调vimentin和N-cadherin介导EMT的发生，从而促进乳腺癌的侵袭、转移。而RASSF7与乳腺癌EMT具体的关联和机制如何则有待深入探究。RASSF7在乳腺癌发生、发展中的作用及机制，可为乳腺癌的防治和分子靶向治疗提供新靶点和思路。