红曲菌深层发酵产业化现状与展望

胡文林 谢凤娇 谭兰英 覃爱红 尚学平

广东天益生物科技有限公司 广东湛江 524300

红曲的发明起源于中国，有千年以上的历史。20世纪30～90年代，中国从事红曲的研究和应用不多，发展也较缓慢。20世纪80年代后期，日本远藤章教授等从红色红曲菌M.ruber中分离出Monacol K及结构相似的其他活性成分[1]，轰动了世界，又激起国人多方面的深入研究和应用。

随着科学的发展，红曲菌的潜能不断被开发，才有了红曲各种各样的神奇功能，液体发酵生产红曲色素，也是近二十年才发展起来的现代生物制品。刚开始，中国的红曲色素是从红曲米提取，它与液体发酵、纯种培养所生产的红曲红相比，色价和纯度及桔青霉素含量等均有差距，最终红曲红产品的安全性能得不到保障。

目前，全世界仅有中国和日本能生产红曲色素，日本对红曲的研究比较透彻，而中国的产业化发展和技术具有明显优势。近几年，中国海峡两岸红曲业界一致推崇红曲，将其视为“国曲”，这是自然馈赠并蕴有人类智慧的宝物，值得国人珍惜。

随着对红曲菌发酵的研究，红曲色素提取纯化工艺的创新和改进，以及红曲发酵产品中各种生物活性物质的发现，及其保健作用与药理功能的阐明，红曲色素在药食两用市场中将扮演着越来越重要的角色。红曲色素在食品加工行业的使用范围逐年增加，产品的市场需求量增长非常快，具有很大的市场潜力。本文主要介绍液体深层发酵红曲色素的产业化进程、产业化工艺控制和红曲的研发方向等方面的现状。

1 红曲霉菌液态发酵红曲色素的研发及产业化进程

1.1 液态发酵红曲色素的发展进程

20世纪80年代开始液体发酵红曲的研发和中小试验，发酵水平不到80u/mL；20世纪90年中期开始规模化生产发酵罐体积为10m3，发酵色价最高达到约200u/mL；20世纪90年代末期发酵罐体积扩大为15m3，发酵色价最高达到约400u/mL；2004年规模化大生产发酵罐扩大到30m3，发酵水平色价从开始的200～300u/mL，经过不断的技术创新和工艺改造，2008年单罐发酵水平突破了900u/mL，最高达到920u/mL；2013年规模化大生产发酵罐扩大到60m3，平均发酵色价稳定在750u/mL，到目前为止年平均发酵色价保持在800u/mL，单罐发酵水平最高达到870u/mL。

经过二十多年的发展，深层发酵红曲色素行业发酵水平取得了巨大的进步，随着科学技术水平创新和提高，我们有信心将深层发酵红曲色素的发酵色价突破1 000u/mL。

1.2 液体深层发酵红曲色素的产业化工艺控制

液体深层发酵红曲色素的技术经过二十多年的发展，已日趋成熟、稳定，较固态发酵优势明显，具有生产周期短、产量高、纯度高、产品质量控制稳定等优点；配方、工艺可控性强，而且可以达到非常高的发酵水平。在产业化生产中，主要通过菌种、原料、配方、工艺控制等措施，达到高产色素而低产或不产桔青霉素的目的，以及控制产品色调，使得产品质量(色调、色价和桔青霉素等指标)能够得到有效的保障。

1.2.1 深层发酵生产红曲色素工艺流程

平板于斜面培养7～8d→种子液培养24～30d→一级种子罐培养7～8h→二级种子罐培养7～8h→发酵罐培养70～80h→第一次压滤→酒精浸提滤饼→第二次压滤→滤液→纳滤→真空浓缩→喷雾干燥→混粉筛粉→包装→成品。

1.2.2 色调

红曲色素是微生物发酵的天然色素的混合物，红曲霉菌分泌的色素大致可分为理化性质相近的紫、红、黄三种类型颜色。在生产实际应用中，由于成本等原因影响，并不将其分离提取，而是直接使用其混合物。

(1)在发酵过程中，因培养基不同，菌种分泌各种颜色色素比例亦各异，可以是通过调整培养基中的碳氮比例来实现。在培养基中，增大氮源，产生的色素就偏向于紫色；增大碳源，产生的色素则偏向于黄色；碳氮比例适中，产生的色素则为红色。

(2)在提取过程中，用乙醇和水这2种方法提取得到的色素比例不同，色调也不同，在分光光度计测定的吸光度和最大吸收波长、波峰高低都存在差异。用2种方法提取的色素都有2个波峰分别在420nm和495nm，波长在420nm处是黄色，在495nm处是红色，在各波长出现波峰的高低不同：醇溶性色素在波长495nm处要比波长420nm处出现波峰高得多，说明红色色素比例较大，以红色色调为主；水提取得到的色素恰好相反。

醇溶性和水溶性色素在不同的pH值范围内均显示不同的色调，大致可分成红色、紫色、黄色3种颜色。用柠檬酸和食用碱调节pH值，其颜色变化如表1。

表1 不同pH值对色调的影响

因此，红曲色素的色调与发酵培养基的碳氮比例和提取工艺等因素有密不可分的关系，并非一成不变。

1.2.3 色价和桔青霉素

红曲色素在食品、医药、化妆品等领域都有着重要的应用。但是红曲色素产品中含有生物毒素——桔青霉素，此生物毒素具有肾毒性，还可致畸、致癌和诱发基因突变等[2]。桔青霉素的产生限制了红曲产品的广泛应用，并成为中国红曲产品走向世界的瓶颈。提高色素生产水平和降低产品中的桔青霉素，是解决深层发酵红曲行业的共性问题。桔青霉素是红曲菌发酵次级代谢的产物之一，可以从菌种筛选、工艺优化等方面进行控制[3]。

(1)红曲优良菌种的选育。

采用传统的改造选育方法，对红曲菌采用紫外诱变、化学诱变和复合诱变等方法，选育出性能稳定、产色高，不产或低产桔青霉素的优良菌种。

(2)原料的选择和配方优化。

经过长期的生产试验跟踪得出：添加玉米浆作为生长因子对红曲菌生成色素有明显促进作用，且不促进桔青霉素的合成。添加无机盐离子对产色和桔青霉素的合成也有不同程度的影响，Mg2+对红曲菌产色基本无影响，而对桔青霉素的产生有较大的促进作用；Zn2+对色素合成的关键酶起激活作用，从而影响色素合成；Mn2+影响HMP途径和TCA循环中某些酶的活性，而影响色素合成量。

(3)发酵生产工艺条件的控制。

A：浓度比。

除了摸索红曲菌高产色素低产或不产桔青霉素的发酵生产配方外，碳氮比和料液浓度比最关重要，碳氮比控制2.5∶1较为合适；pH值3.0～4.5条件下最适合红曲菌生产和代谢产物的产生。

B：温度。

红曲菌最适生长温度为28～36℃，为了缩短生产周期，提高设备使用率，提高培养的温度，可以达到更好的效果。在对菌种选育时，对红曲菌在温度为35～38℃进行处理，使得筛选菌种具有产色高、性能稳定和培养粗放的特点；经多次试验表明：适当提高红曲菌发酵生产温度(35.5～36.5℃)，不但可以节能降耗，而且还能达到高产色素，降低桔青霉素。

C：通风比。

红曲菌属于好氧菌，在生产和发酵的培养过程中需要通入大量的压缩空气即通风量，确保培养基中有充足的溶氧，通风量会影响菌种的生长和代谢产物的分泌，同时也会影响发酵周期。实验表明：通风比在1∶(0.3～0.6)时，菌种生长的每个时期所需的溶解氧会不一样，应该进行适当的调整，使得红曲菌的生长期缩短，旺盛期延长，达到出现高产色素，低产或不产桔青霉素目的。

D：后提取精制工艺的革新。

提取及去除桔青霉素的工艺流程是发酵结束后，加酸将发酵液pH值调低，在较低的pH值情况下，色素及菌体充分沉淀，通过压滤将含有桔青霉素的上清液分离，排除废液得到滤饼。在滤饼中加入酒精进行色素萃取，萃取液借助纳滤膜过滤除盐，并通过真空浓缩的手段进行分离并回收酒精，将浓缩液加入糊精进行喷雾干燥得到产品，最后通过混粉将产品调节到相应规格并包装成成品。

1.2.4 产品质量标准的检测

目前，红曲色素的质量标准主要是色价和桔青霉素等两个关键指标。色价一检测般采取比色法。桔青霉素的测定方法主要采用HPLC法、酶联免疫法、TLC法、抑菌圈法等[4]；其中HPLC法是目前检测红曲中桔青霉素高效且应用最广泛的方法，中国红曲色素国家标准规定的方法是HPLC法，而国际上公认比较权威的检验方法是液相色谱-质谱联机或液相二级质谱，该方法准确度和灵敏度都很高，但使用该方法的成本较为昂贵，目前无法广泛使用。

经过长期的连续产业化生产验证，公司在深层发酵红曲色素技术方面取得了突破性的成果，得到了一套高产色素低产或不产桔青霉素的深层发酵工艺，解决了行业中存在的桔青霉素含量超标问题，红曲色素产品桔青霉素含量达到中国和日本等国家的标准(如表2)，年平均发酵水平为800u/mL，发酵可年产1 200 t红曲色素，是目前规模和产能最大的企业之一。

表2 深层发酵红曲红样品桔青霉素含量的测定结果

2 固体发酵生产红曲米工艺

传统的红曲米生产工艺为固态发酵培养法，已有上千年的历史。早期为地面表层培养，该方式投入少，操作简单，但红曲产量低且易受杂菌污染。20世纪80年代至今，主要采用通风曲池培养[7]，该方式采用液-固两步法进行培养，即采用液态发式培养菌种，接种于固态物料，工艺上较固-固发酵有了较大的进步。

为进一步解决传统红曲米桔霉素超标和劳动强度大等行业难题，公司经过长期的研究试验，目前建成一条投料量8～10t的米机械化生产线，红曲米色价达4 000～6 000u/g。该设备在借鉴日本单层曲室式圆盘自动制曲机基础上，结合国内实际生产工艺而设计制造的固态发酵器(圆盘制曲机)，实现了机械化操作，蒸米、接种、出料、培养过程中的翻料，均由机械实现操作，在整个操作工程中，人与物料不直接接触，避免了交叉污染。占地面积小，是行业中固体制曲的先进设备。

3 红曲的研究与发展方向

自20世纪80年代以来，功能性红曲中的Monacolin类化合物，被陆续发现并证实具有显著抑制体内胆固醇合成的活性，Monacolin类化合物中Monacolink K是最主要的他汀类物质,是一类高效的降脂药物，能有效地抑制胆固醇合成限速酶HMG-Coa还原酶的活性，降低人体内源性胆固醇合成，减少细胞内胆固醇贮存，降低血液中低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)的浓度[1]，因此，红曲的保健和药理作用得到了认可。而功能红曲行业目前的生产方式(固体瓶式发酵)使得产能增加的局限性很大，技术水平难以提升，行业发展受限。21世纪初以来中国在液态发酵生产方面做了大量工作，研究初见成效，采用这种生产方式有助于实现生产自动化，提高产品质量稳定性，扩大生产规模，工艺调整灵活性强。

3.1 功能性红曲生产的情况

3.1.1 功能红曲的发酵方式

(1)固态发酵法[6]。功能性红曲天然发酵可分为固态发酵和液态发酵2种发酵状态。液态发酵法设备投资大、生产成本也较高。目前国内外降脂功能性红曲的生产以固态发酵法为主。根据发酵容器，可分为三角瓶(或其它发酵瓶)发酵、浅盘发酵、固体发酵装置发酵。大规模的固体发酵装置从理论上来讲是可行的，但设备投资大，有些技术尚不够成熟，可用于功能性红曲米的固态发酵罐系统还未达到实用化水平。因此，瓶式发酵和浅盘发酵是目前降脂功能性红曲的主要生产方式。根据这种原始的生产方式，我们可以得出推论：真正发酵降脂功能性红曲的生产成本一般比较高。

(2)液态发酵法[7]。液态发酵功能红曲主要采用碳源、适量的氮源加水调成培养基，在发酵罐进行灭菌、发酵的生产方式。优势比较明显，自动化程度高，容易提高产能，工艺可控性强，具有巨大的发展潜力。

3.1.2 生产特点

(1)发酵周期长。红曲中的功能性成分莫纳可林K(MK)的合成属于次级代谢产物，一般在菌体生长结束后才逐渐开始大量的合成。因此功能性红曲的发酵周期相对较长。

(2)降脂功能性红曲的特征。功能性红曲样品中莫纳可林K(MK)均是同时含有开环结构和闭环结构的。在发酵10d及以前更是全部都是开环，不存在闭环。在其后的发酵过程中开环结构的莫纳可林K(MK)比例一般在65%～85%，远远高于闭环结构。但功能性红曲产品的烘干工艺会造成这2种比例的变化。产品烘干过程中，温度越高，烘干时间越长，则开环结构转化为闭环结构的就越多[5]。目前关于功能性红曲的检测方法，轻工行业标准GB/T2847-2007《功能性红曲米(粉)》中有比较全面的莫纳可林K(酸式和内酯式)的检测方法，但2003年版卫生部《保健食品检验与评价技术规范》中关于洛伐他汀的检测，只用内酯型(即闭环)的洛伐他汀的数据来表示检测结果，这不能客观的反映功能性红曲样品的特征(即2种结构共存，一般情况下内酯式比例高于酸式)，会大大制约其在保健品中的应用。

3.2 菌种的活化和分离纯化[8]

3.2.1 斜面菌种的活化

将冰箱保存的斜面菌种接种于麦芽汁斜面，置32℃恒温箱培养7d，备用。

3.2.2 斜面菌种的分离纯化

将活化的斜面菌种制备单孢子悬液，然后稀释涂平皿，培养，待平板上长出单个菌落，接种试管斜面，如此反复若干次，直至分纯为止。

3.2.3 孢子悬液的制备

斜面菌株培养7d，用约10mL无菌水洗下斜面红曲霉孢子，倒入已灭菌装有20～30颗直径为4～5mm玻珠的三角瓶中，振荡约5min，孢子分散即可，稀释至浓度为105个/mL。

3.2.4 种液制备

装液量200mL/1 000mL三角瓶，接种量5%，置于转速为200rpm的摇床，30℃恒温培养48h。

3.2.5 固体发酵培养

装料量150g/1 000mL三角瓶(150g指干重)，接种量10%～15%,25℃培养30d。30d后烘干，再用高效液相色谱法进行莫纳可林K(MK)含量测定。

3.3 固体发酵培养基的优化

在固体发酵的最初阶段，一般选用单一的原料作为固体发酵的培养基，如大米、小米、燕麦、玉米等，但最终莫纳可林的含量都不是很高，同时还存在产生桔青霉素过高的风险。目前一般选用2种或以上原料进行复配发酵，以提高含量，降低或消除桔青霉素的含量。

3.4 开发研究方向[9]

加强对现有科研成果的开发应用，生产具有时代意义的新型红曲保健食品、饮品和药品，更好地为人们健康服务。本着预防为主的现代社会观念，加强对高血脂症的早期治疗，做好心脑血管疾病的一级预防，显得尤为重要。目前，已在日本和中国台湾成功上市的红曲保健食品：红曲清酒、米醋、高盐分食品(酱油、味噌、红豆腐乳)、肉制品、面食、低胆固醇鸡蛋及鸡肉的生产。中国大陆也有较大的进步，市场上也有少量的红曲饼干、面条、酒、肉酱等保健食品。随着对红曲相关知识的宣传和普及，国人对红曲的了解越来越深入。红曲的保健和药用价值也得到人们的认可，其相关产品也深受国人喜爱，市场需求量将迅速增长。因此，我们对红曲保健食品的的研究开发力度还要加大，并且要多元化发展。期待与国内外科研院校、企业合作，共同促进红曲行业的发展，使得国宝东方神曲能遍布神州大地。

4 展望

随着中外的专家学者对红曲菌研发的不断深入，对人体有益的功能性成分越来越清晰、明确，红曲菌能产生多种对人类有益的代谢产物：ACE抑制肽和-氨基丁酸(GABA，降血压)，支链氨基酸(减肥)，Dimerumic酸(护肝)、黄酮酚(抗氧化)，麦角固醇(预防骨质疏松)，辅酶Q10(抗衰老)。红曲的功效成分对调节血脂、心血管系统、抑制胆固醇合成、保护肾脏和肝脏、抗癌、防衰老抗氧化等方面都有明显的药理作用，采用红曲菌深层发酵法实现产业化生产是未来发展的趋势和方向，这也是深层发酵的优势所在。可以通过对菌种改良和筛选、液体发酵工艺优化、代谢产品基因调控、生成机制、多菌种混合发酵等方面措施综合控制，促进红曲菌定向代谢功能性有效成分，提高发酵水平和产能，让红曲产品变得越来越普遍，发展前景十分广阔。