玄黄药膏对急性软组织损伤大鼠免疫功能影响的实验研究

程 延，赵朝伟，李 浩，杨谢安，魏 兵，王彦鹏，全 健，窦群立，昝 强

(1.陕西省中医医院，陕西 西安 710003；2.洛南县中医医院，陕西 洛南 726100；3.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712021)

急性软组织损伤是骨科常见病、多发病，中医属“筋伤”范畴，可单独出现，也可同时伴有骨折，损伤后的肿痛和肢体活动受限，给患者造成很大痛苦，甚至导致不同程度的残疾而严重影响患者身体健康和生活质量，对其治疗的研究日益受到重视。在暴力作用下，机体皮肤、肌肉、肌腱、筋膜、韧带等软组织受到撞击、扭转、牵拉等作用后，随即出现急性无菌性炎症改变，伴随免疫功能降低或紊乱。资料表明，中医药对于损伤的软组织有较好的治疗作用和免疫调节作用。中药具有资源丰富、用药成本低、药力持久、低或无副反应等优点，研制具有免疫调节作用的中药制剂是新药开发的重要内容[1]。玄黄药膏是我院用于治疗“气滞血瘀型”急性筋伤(急性软组织损伤)的经验方，临床实践证明，该药疗效显著，安全、未出现毒副作用及过敏反应，取得较好的临床效果[2-4]。动物实验证明[5-6]，玄黄药膏可以降低损伤局部组织中如白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)等多种炎症因子含量而发挥较好的抗炎、镇痛作用。本研究在以往研究的基础上，通过动物实验探讨玄黄药膏对急性软组织损伤大鼠免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SD大鼠90只，雌雄各半，体重237～401 g，平均313.33 g，购自西安交通大学实验动物中心，动物资格证号：SCXK(陕)2017-003。实验在陕西中医药大学动物实验室进行，动物室室温19～24 ℃，相对湿度约40%。实验前选用标准大鼠饲料适应性喂养3 d，自由清洁饮水，每两天清洁笼具1次。

1.1.2 主要试剂和仪器：玄黄药膏：由酒大黄15 g，栀子30 g，蒲公英9 g，乳香、没药各8 g，虫3 g组成。购自陕西省中医医院中药房，药监合格，药物按比例粉碎，用100目筛子筛为细末备用。样品药制备：用凡士林为基质与药粉以质量比为1∶1的比例制成所需药膏。扶他林软膏(北京诺华制药有限公司生产，国药准字H19990291)。无水乙醇、中性树胶、7%硫化钠溶液、10%水合氯醛溶液等由西安恩斯维尔生物公司提供，姬姆萨复合染液、苏木精染液、液体石蜡、伊红染液、甲醛溶液等由北京索莱宝公司提供。烧杯、采血管、刻度试管、高精度加样器、离心管、移液枪、包埋盒、切片刀头、一次性吸管等由西安恩斯维尔生物公司提供，分光光度计、天平、水浴锅、恒温箱、包埋机、切片机、高速冷冻离心机等由陕西中医药大学动物实验中心提供，局部打击器。

1.2 实验方法

1.2.1 造模、分组与给药：将动物随机分为实验组、对照组和空白组三组，每组30只。术前脱毛处理：实验前1天用8%硫化钠涂抹于大鼠左侧大腿中部。造模方法[7]：将大鼠麻醉后，选择左侧后肢大腿中部外侧肌肉丰隆处，使用100 g砝码、从垂直高度50 cm处，自由落体落下，准确打击，反复进行3次，造成皮下瘀斑、肿胀的闭合性软组织损伤模型，且无骨折和开发性破损。造模成功30 min后开始给药，实验组、对照组和空白组分别予玄黄药膏和扶他林、凡士林各3 g外敷，医用纱布覆盖创面，胶布固定。每24 h换药1次。连续治疗7 d后测量各指标。

1.2.2 淋巴细胞转化率检测：取大鼠尾部静脉血1滴，置于玻片的一端，另取边缘光滑平整的玻片作推片，使血滴成片状，推成血膜(头、体、尾分明)干燥，等其干燥后用姬萨姆染液染色3～7 min，再用生理盐水冲洗，滤纸干燥后使用油镜观察。计算淋巴细胞转化率：观察每张玻片的头、体、尾三段。每段各一纵列(目的是减少误差)，每张玻片计数200～400个细胞，计算转化率，其中头部50～100个，体部50～100个，尾部100～200个。一般认为转化率的正常值为60%～70%。计算公式：淋巴细胞转化率=转化淋巴细胞/(转化淋巴细胞+未转化淋巴细胞)×100%。

1.2.3 巨噬细胞吞噬百分率及吞噬指数：治疗第4 天(即正式采集标本前72 h)将5%可溶性淀粉酶注射入各组大鼠腹腔中作为诱导剂使大鼠产生腹腔巨噬细胞。实验前1 h向大鼠腹腔注射5%鸡红细胞悬液(具有清晰细胞核)0.6 ml，全部注射后轻柔大鼠腹部2 min。水合氯醛镇定麻醉下在大鼠腹部中央使用剪子剪开皮肤一小口，暴露腹膜，是用镊子提起腹膜剪一小口，使用无菌吸管吸取腹腔液，滴入玻片中，使用另一张洁净玻片推片，置入37 ℃温箱中孵育30 min。取出涂片，生理盐水轻轻冲洗表面，待自然干燥后使用姬姆萨怀特(Giemsa-Wright)染液染色，3 min后再用生理盐水轻轻冲洗，滤纸滤干水分，使用丙酮-甲醇溶液进行固定，并盖上盖玻片。放入油镜下观察200个巨噬细胞吞噬鸡红细胞数，并计算吞噬百分率及吞噬指数[8]。计算公式：吞噬百分率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/200个巨噬细胞×100%，吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数。

1.2.4 补体活性检测：每组大鼠心脏取血、静置。第1步：制备50%溶血标准管，取2%绵羊红细胞悬液2 ml加入蒸馏水8 ml，待细胞完全溶解后为100%全溶血管。取全溶血管上清液2.5 ml并加入巴比妥缓冲液2.5 ml，1∶1混匀后，即为50%溶血标准管。第2步：制备大鼠血清，将大鼠水合氯醛镇定麻醉后，心脏取血，将血液分别放入无菌试管中4 ℃冰箱静置保存，待血液分层后用无菌吸管将大鼠血清吸出放入无菌锥瓶混匀，再使用无菌刻度吸管每次吸入1 ml血清放入小离心管内盖好并-60 ℃保存。第3步：测算血清补体活性，实验前取1只大鼠血清于室内融化，后取大鼠血清0.2 ml与巴比妥缓冲液3.8 ml进行1∶20稀释，取10支试管，顺序编号后按表1所示将各试剂加入、混匀，其中抗绵羊红细胞溶血素按效价稀释至1∶2000，置于37 ℃水浴箱中30 min后拿出，将各反应管以2500 r/min离心5 min，先目测观察各管并与50%溶血标准管比较，选择溶血度与标准管最接近的两管，用分光光度计于波长542 nm处进行比色。巴比妥缓冲液为空白矫正零点，按透光率百分比比测找出最接近标准管的一管，根据该管血清使用量，测算补体活性[9]。计算公式：补体活性(U/ml)=1/血清用量(ml)×血清稀释倍数。

1.2.5 脾重及脾指数：大鼠称量体重后，处死开腹，摘除脾脏，滤纸吸干残留血液及腹腔液，分析天平称重。计算公式如下：脾指数[10]=脾脏重量(mg)/体重(g)。

1.2.6 组织病理学观察：取各组大鼠肌纤维，行HE染色，镜下观察各组大鼠肌细胞情况。

2 结 果

2.1 各组大鼠淋巴细胞转化率、吞噬百分率和吞噬指数比较 治疗7 d后，与空白组相比，实验组与对照组大鼠淋巴细胞转化率、吞噬百分率和吞噬指数均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；实验组与对照组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠淋巴细胞转化率、吞噬百分率和吞噬指数比较

2.2 各组大鼠补体活性、脾重和脾指数比较 治疗7 d后，实验组和对照组大鼠补体活性以及脾重、脾指数与空白组相比均增强或升高，差异有统计学意义(P<0.01)；实验组与对照组大鼠补体活性、脾重和脾指数比较，差异无统计学意义(均P>0.05)，见表2。

表2 各组大鼠补体活性、脾重和脾指数比较

2.3 各组肌纤维组织病理学改变 空白组肌纤维排列规则，分界清晰，细胞形态正常，染色均匀，未见明显异常；对照组肌纤维排列规则，分界清晰，细胞形态正常，染色均匀，局部出血，间质可见少量炎细胞浸润；实验组肌纤维排列规则，分界清晰，间质可见少量炎细胞浸润，局部可见出血(图1)。

图1 三组大鼠肌纤维组织病理图片(HE染色，×200)

3 讨 论

机体受到外伤时免疫系统迅速作出反应，随后发生一过性的改变，这种改变可归类为“促炎”和“抑制炎症”反应。正常机体有一种精细的调节功能，将免疫应答控制在适当范围内。一旦这种调节作用受损或丧失，会对机体造成损伤。人为的进行干预，使机体避免产生异常的免疫应答，或使已出现的异常免疫应答得以逆转，是现代多种疾病免疫治疗形成和发展的基础[11]。目前，西药免疫治疗药物如补体活性抑制剂依库丽单抗等广泛应用于临床，虽有疗效，但治疗局限，毒副作用大[12]。中药及方剂大多属天然动植物，药理应用体系多样，且耐药性低、不良反应少。因此，探寻更加安全、有效的具有免疫治疗作用的中药有着重要的意义。我国学者为此做了大量研究。曹锦花[13]研究发现，茵陈、黄芩等组成的方剂具有清热解毒、利胆退黄、调节免疫作用。缪频等[14]应用中药方(由茵陈、青蒿、黄芩等组成)治疗新生儿ABO血型产前溶血，提示该方可降低血清胆红素水平，提高免疫功能，有效率达95.00%。田昕[1]研究发现，外用乙乙膏(桑寄生、鸡血藤、大黄等)可调节急性软组织损伤大鼠体液免疫和细胞免疫状态，增强机体对免疫器官的保护和恢复作用。研究表明，杜仲、木香、金银花具有良好的抗补体活性作用，研究和发掘抗补体活性的中药必将为临床提供多样化的治疗方式[15]。本方中大黄、虫有破瘀通经、消肿止痛的作用，乳香、没药活血行气，栀子、蒲公英清热舒筋，共同协助大黄化瘀泄热。本实验进一步探讨其对损伤机体免疫功能的影响。

机体受抗原刺激后，淋巴细胞发生变化，向淋巴母细胞转化，释放淋巴因子等一系列免疫物质，促进损伤修复。巨噬细胞是机体免疫应答的重要效应和调节细胞，参与天然免疫，并在获得性免疫应答中起协同作用，具有分泌多种细胞因子，捕捉、吞噬、溶解病原体，参与抗原递呈等作用[11]。机体的非特异性免疫功能一定程度上由巨噬细胞吞噬活性大小反应完成[16]。淋巴细胞转化率、巨噬细胞吞噬率变化可反映细胞免疫的状态和机体损伤的恢复能力[1]。本实验显示，经玄黄药膏和扶他林治疗的大鼠，腹腔巨噬细胞吞噬率、吞噬指数和淋巴细胞的转化率均有不同程度的增加，与空白组比较有统计学差异，说明本方能够提高大鼠巨噬细胞的吞噬率和淋巴细胞转化率，对体内的免疫功能有促进作用。

补体是具有酶活性的蛋白质，存在于人和脊椎动物血清和组织液中，其正常活化有利于增强免疫力，但过度激活可引起组织损伤等[17-19]。补体能使溶血素(抗绵羊红细胞抗体)致敏的绵羊红细胞发生溶血，绵羊红细胞浓度恒定时补体活性与溶血程度呈正比。因此，可通过溶血程度来判断血清中的补体含量，反映其对机体体液免疫功能的影响[1]。免疫器官(如胸腺、脾脏)重量变化在一定程度上反映了机体的免疫功能。李覃等[20]研究表明，中药青蒿素能明显降低迟发型超敏反应模型小鼠免疫器官的脏器(胸腺、脾)指数，显示出一定的免疫抑制效应。本实验中，玄黄药膏与空白组相比大鼠补体活性增强，脾重和脾指数升高，提示玄黄药膏有利于促进大鼠体液免疫功能，对免疫器官功能有保护作用，与上述研究结论一致。

综上所述，本实验结果显示，玄黄药膏可使急性软组织损伤大鼠淋巴细胞转化率提高、腹腔巨噬细胞吞噬功能和补体活性增强、脾重量和脾指数增加，提示玄黄药膏治疗急性软组织损伤可能与抗炎作用和增强机体的免疫力有关。但值得提出的是，因为正常个体免疫系统有一定的代偿能力，免疫应答机制会得到恢复乃至增强以提高自身的抗病能力，恢复速度及程度取决于创伤的严重程度和持续时间，而且，重度创伤(如严重软组织伤)对免疫功能有明显的抑制作用，轻度创伤则有增强作用[21-23]。本实验动物模型建立在相对“轻的软组织损伤”基础上，治疗中未出现因免疫反应增强而发生的组织损伤，说明玄黄药膏协同增强免疫功能而发挥了积极作用。所以，本实验未能回答玄黄药膏对促进免疫功能是否最优化及最优化的使用量、是否对严重的软组织伤的免疫抑制有效等问题，值得进一步研究。