陈振兴,周凤玲,张仲敏
(广西中医药大学,广西 南宁 530200)
酸藤子Embelia laeta(L.)Mez为紫金牛科酸藤子属植物,收载于《广西壮族自治区瑶药材质量标准》(第一卷),以根入药,是瑶族经典药“老班药”“七十二风”中的风药之一,主要用于慢性肠炎、月经不调、血崩、风湿痛、类风湿性关节炎等疾病[1]。研究发现酸藤子中含有丰富的黄酮类化合物[2],冯旭等[3]在酸藤子中分离得到芦丁、金丝桃苷、槲皮素、山柰酚、金圣草黄素等黄酮类化合物。黄酮类化合物具有广泛的药理作用,但鲜见对酸藤子黄酮类成分进行药理研究。在广西、广东两地,酸藤子资源较为丰富,民间应用广泛并且具有较好的临床效果[4-5],研究潜力巨大。目前国内外对酸藤子研究报道较少,限制了对此药的深入研究及资源开发。本文在前人的研究基础上[6-8],对11种不同产地酸藤子根的总黄酮进行了提取和测定,并初步观察了不同产地酸藤子根提取物的抗氧化作用,为酸藤子的药物开发提供科学依据。
1.1 试药 酸藤子药材分别采自广西壮族自治区(钦州市灵山县、钦州市浦北县、贵港市平南县、玉林市容县、柳州市鹿寨县、南宁市青秀区、来宾市金秀县)和广东省(潮州市饶平县、江门鹤山市、茂名市电白区、汕尾陆丰市),经广西中医药大学中药鉴定教研室蔡毅教授鉴定为酸藤子Embelia laeta(L.)Mez。
1.2 仪器 UV-1100型可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);梅特勒XS105 DualRange十万分之一电子分析天平[梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司];优普纯水制造系统(厦门锐思捷水纯化技术有限公司)。
1.3 试剂 总抗氧化能力测定使用试剂盒(购于南京建成生物科技公司);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,纯度≥98%)、水溶性维生素E类似物Trolox(纯度≥98%),均购于合肥博美生物科技有限责任公司;芦丁(批号:wkq20030203,纯度>98%),购于四川省维克奇生物科技有限公司;水为超纯水;亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇等试剂均为分析纯。
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取2 mg干燥至恒重的芦丁对照品,置于10 ml的容量瓶中,加70%乙醇溶解,摇匀,定容至刻度,即得0.2 mg/ml的芦丁对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液的制备 精确称取11种不同产地酸藤子根粗粉各2 g,按料液比1∶20(g/ml)加入70%乙醇40 ml,在超声功率300 W的条件下超声提取40 min,抽滤,重复提取3次,滤液合并,减压浓缩后用70%乙醇定容至100 ml,备用。
2.2 方法学考察
2.2.1 标准曲线的绘制 参照文献[9-12]方法,精确吸取0.4 ml、0.8 ml、1.2 ml、1.6 ml、2.0 ml、3.2 ml对照品溶液,分别置于10 ml容量瓶中,加5%亚硝酸钠溶液0.3 ml,摇匀,放置5 min,加10%硝酸铝溶液0.3 ml,摇匀,放置5 min,加4%氢氧化钠溶液4 ml,再用70%乙醇定容至刻度,摇匀,放置15 min。以乙醇作空白,于510 nm波长处测定吸光度(A)。以芦丁对照品浓度为横坐标(C),吸光度为纵坐标(A),求出回归方程:A=12.993C-0.004,r2=0.999;表明芦丁质量浓度在0.008~0.064 mg/ml范围内有良好的线性关系。
2.2.2 精密度试验 精确吸取芦丁对照品溶液1 ml,置于10 ml容量瓶中,按照2.2.1项方法进行显色,显色后平行测定吸光度6次,结果RSD为1.46%(n=6),表明仪器精密度良好。
2.2.3 稳定性试验 精确吸取芦丁对照品溶液1 ml,置于10 ml容量瓶中,按照2.2.1项方法进行显色,显色后于0 min、15 min、30 min、45 min、60 min时测定吸光度,结果RSD为2.44%(n=5),表明总黄酮溶液在显色后60 min内具有良好的稳定性。
2.2.4 重复性试验 精确称取汕尾陆丰市酸藤子根粉末6份,各2 g,按2.1.2项方法制备供试品溶液,取1 ml该溶液,置于10 ml容量瓶中,按照2.2.1项方法进行显色,显色后测定各溶液的吸光度,结果RSD为1.68%(n=6),表明该方法重复性良好。
2.2.5 加样回收率试验 精确称取汕尾陆丰市酸藤子根粉末2 g,加入一定量的芦丁对照品,按2.1.2项方法制备样品溶液6份,取1 ml该溶液,置于10 ml容量瓶中,按2.2.1项方法显色后测定吸光度,计算出平均加样回收率为99.68%,RSD为2.05%(n=6),表明该方法适合酸藤子根总黄酮含量的检测。
2.2.6 样品测定 按2.1.2项方法制备11种不同地区酸藤子根的提取液,精确吸取1 ml置于10 ml容量瓶中,按2.2.1项方法显色后测定吸光度。根据芦丁标准曲线计算样品中总黄酮的含量,结果见表1。
表1 11个产地酸藤子根中总黄酮的含量(n=3)
2.3 体外抗氧化活性测定
2.3.1 总抗氧化能力(T-AOC)测定[13-15]依照测定试剂盒说明书规定方法进行测定,并按下列公式计算总抗氧化能力。总抗氧化能力(U/ml)=(测定OD值-对照OD值)/0.01×30×(反应液总量/取样量)。式中:测定OD值为测定管吸光值,对照OD值为对照管吸光值,反应液总量为液体总体积,取样量为0.1 ml。计算出11种不同产地酸藤子根溶液浓度为20 mg/ml时的总抗氧化能力,结果见表2。
表2 11个产地酸藤子根溶液总抗氧化能力(n=3)
2.3.2 清除DPPH自由基能力的测定[16-17]取2.1.2项方法下制备的11种不同产地酸藤子根溶液适量,稀释至各浓度(0.02 mg/ml、0.04 mg/ml、0.08 mg/ml、0.12 mg/ml、0.20 mg/ml),分别精密量取2 ml,与2 ml的0.1 mmol/L DPPH溶液混合摇匀,暗处静置30 min,以70%乙醇为空白,于波长517 nm测定吸光度A1。空白对照:取2 ml 70%乙醇与2 ml不同浓度的酸藤子根提取液混匀,暗处静置30 min,以70%乙醇为空白,于波长517 nm测定吸光度A2。阴性对照:将2 ml的0.1 mmol/L DPPH与2 ml 70%乙醇混匀,暗处静置30 min,以70%乙醇为空白,于波长517 nm测定吸光度A0。按公式计算出各浓度的酸藤子根提取液DPPH清除率,DPPH清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%,结果见图1。并按上述方法测定Trolox阳性对照物浓度分别为0.005 mg/ml、0.01 mg/ml、0.02 mg/ml、0.04 mg/ml、0.05 mg/ml时对DPPH自由基的清除率,计算出Trolox溶液对DPPH的清除能力。清除能力用IC50值表示,IC50值越小说明清除自由基的能力越强。不同地区酸藤子根提取液和Trolox溶液对DPPH自由基清除能力结果见表3。
图1 不同产地酸藤子根提取液对DPPH自由基清除率
表3 11种不同产地酸藤子根提取液对DPPH自由基的清除能力 (n=3)
2.4 总黄酮含量与抗氧化活性相关性分析 采用Pearson相关性分析不同产地酸藤子根总黄酮含量与抗氧化活性的相关性,结果见表4。
表4 总黄酮含量与抗氧化活性相关性结果
2.5 数据处理 所有试验均独立重复3次,试验结果用均数±标准差(x±s)表示。采用Excel 2019软件进行数据处理,应用SPSS 23.0软件进行Probit回归分析,计算DPPH自由基的半数清除浓度IC50值,并使用Pearson相关性分析酸藤子根总黄酮含量与抗氧化活性的相关性。
11种不同产地酸藤子根的总黄酮含量范围为:11.06~29.80 mg/g。其中,南宁市青秀区酸藤子根的总黄酮含量(11.06 mg/g)最低,潮州市饶平县酸藤子根的总黄酮含量(29.80 mg/g)最高,两者相差3倍左右。不同产地酸藤子根总黄酮含量有所不同,可能是由于采收时间、野生环境和地理位置等因素的影响,其具体原因需要进一步的探讨。
酸藤子根中总黄酮含量较多,黄酮类成分已被证实具有一定的抗氧化作用[18],体外抗氧化活性的测定方法有多种,所对应的反应原理各不同,具有各自的优缺点[19-20],本实验选用总抗氧化能力和清除DPPH自由基能力对酸藤子根总黄酮溶液的氧化活性进行初步测定和评价。总抗氧化能力(T-AOC)测定法的原理是将Fe3+还原成Fe2+,后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物,通过比色法可测出其还原能力,良好的还原能力对应着良好的抗氧化能力。11种不同产地酸藤子根总黄酮溶液的总抗氧化能力较强,最强的是汕尾陆丰市的酸藤子,最弱的是南宁市青秀区的酸藤子。其中,有8个产地的总抗氧化能力都在70 U/ml以上。DPPH法是筛选天然抗氧化剂、评价化合物抗氧化能力的最常用方法之一,DPPH自由基是一种人工合成的、稳定的有机自由基,当向DPPH自由基溶液中加入自由基清除剂,孤对电子被配对,深紫色的DPPH自由基被还原成黄色DPPH-H非自由基形式,其褪色程度与所接受的电子数量成定量关系,DPPH法已在全世界范围内被广泛用于自由基清除能力的定量分析[21]。本研究中,11种不同产地酸藤子根总黄酮溶液对DPPH自由基均有较好的清除能力,在0.02~0.20 mg/ml质量浓度范围内,随着浓度的增加,DPPH自由基清除效果增强,当清除率达到80%以上后,随着浓度的增加,清除率呈缓慢增长趋势。其中,对DPPH自由基的清除能力最强的是潮州市饶平县的酸藤子,最弱的是南宁市青秀区的酸藤子。
不同产地酸藤子根所表现的抗氧化活性有明显差异,通过相关性分析可知,不同产地酸藤子根总黄酮含量与总抗氧化能力相关系数为0.446(P=0.169),没有统计学意义,原因可能是在总抗氧化能力评价中,发挥抗氧化作用的成分并非仅仅是黄酮类,可能还有其他化学成分,如皂苷类、酚酸类和蒽醌类成分等[2,22-23];不同产地酸藤子根总黄酮含量与清除DPPH自由基能力相关系数为-0.646(P=0.032),分析结果表明两者具有明显的负相关性,即总黄酮含量越高,其半数清除浓度越低。说明酸藤子根总黄酮含量与其清除DPPH自由基能力密切相关。
本实验研究测定了不同产地酸藤子根总黄酮含量,并初步分析其抗氧化作用,为今后深入研究及酸藤子资源的合理开发利用提供了有力的理论依据。