基于同步辐射衍射增强成像的CCl4诱导肝纤维化发展及逆转动态研究

王子博，吕文娟，赵新颜，赵雨晴，李一珉，胡春红*

1.天津医科大学生物医学工程与技术学院，天津 300070；2.天津市胸科医院，天津 300222；3.首都医科大学附属北京友谊医院，北京 100050；*通讯作者 胡春红 chunhong_hu@hotmail.com

肝纤维化是肝脏对慢性损伤的一种愈合反应，会导致纤维面积不断增加，肝脏表面纹理和内部血管结构也发生变化[1-4]。肝纤维化是可以逆转、消退的动态过程，持续发展会演变为肝硬化甚至肝癌，引起门静脉高压、腹水等并发症，很难再逆转和治愈[5-6]。因此，研究肝纤维化的发展与逆转过程中肝脏的胶原沉积和表面形变程度等显微病理特征，有利于从形态学角度探究肝纤维化的病理机制。

目前，肝活检等组织病理方法是研究肝纤维化微结构变化的“金标准”，但该技术取样面积小，存在取样误差，对组织有破坏性。X线、CT、超声、MRI等影像学检查的空间和衬度分辨率较低，无法反映肝组织内的细微病理变化。X线相位衬度成像简称相衬成像，通过记录X线穿透物体后相移信息的变化成像，解决了生物软组织的微观成像问题[7-8]。衍射增强成像（diffraction-enhanced imaging，DEI）是一种典型的相衬成像，其衬度机制主要来自于样品对X 射线的吸收、折射和小角散射作用，能够提高图像的衬度分辨率和空间分辨率[9]。本研究拟利用DEI 的优势，对肝纤维化发展及逆转不同阶段的微观结构变化进行研究，从而为肝纤维化的辅助分析和病理机制研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 肝纤维化动物模型制备和分组 54只清洁级BALB/c 小鼠，体重20～30 g。实验前，小鼠按简单随机化方法分为正常组6只和实验组48只。实验组小鼠经腹腔注射40% CCl4橄榄油浑浊液（CCl4∶橄榄油=2 ml∶5 ml）0.2 ml/100 g，每周2次，正常组仅注射相同剂量的橄榄油。所有小鼠均于20～25℃、40%～70%湿度的环境中分笼饲养，采取相同的喂养方式，自由饮水并饲喂标准饮食。实验组小鼠注射CCl4橄榄油浑浊液42 d，并于停止注射后自发逆转45 d。于0 d，注射后8、14、21、42 d 及逆转8、18、35、45 d 各取6只小鼠肝脏组织固定于中性福尔马林溶液中。成像前将样品从福尔马林溶液中取出，自然干燥12 h 行DEI，随后将样品放回福尔马林溶液中待病理检查。本实验研究经首都医科大学附属友谊医院动物伦理委员会批准，样品处理过程符合动物伦理委员会规则。

1.2 DEI 实验装置和数据采集 DEI 实验在北京同步辐射装置4W1A 形貌成像实验站DEI 装置上进行。实验装置的主要元件单色器晶体和分析晶体均选用Si(111)晶面。本实验所用X 射线探测器像素大小10.9 μm×10.9 μm，X 射线光能量15 keV，分析晶体转台旋转角度精度为0.05 s，分析晶体角度旋转步长为0.5°/s。

1.3 病理检查 DEI 实验后，肝脏样品行常规脱水、石蜡包埋、4 μm 厚切片，随后行天狼星红染色，于光学显微镜下采集病理图像。每组分别随机选取不重叠的20 张切片作为感兴趣区，使用Image Pro Plus 6.0软件计算切片的胶原面积比，即胶原面积与整张切片中肝脏样品总面积的比值。由1名具有10年以上临床经验的肝脏病理科副主任医师采用盲法分析病理图像。

1.4 肝脏表面纹理分析 纤维化肝脏由于受到胶原沉积影响，不仅血管形态结构及数量发生改变，肝脏表面形态也会发生改变，表现为肝表面粗糙度增加并分布不均。为了定量分析肝纤维化动态发展和逆转不同阶段的肝表面粗糙程度，每组随机挑选24个大小为100×100 像素的肝脏表面图像作为感兴趣区，然后对感兴趣区进行灰度共生矩阵纹理分析。选取的纹理参数包括惯量、逆差矩、差的均值、差的熵。

1.5 统计学方法 采用SPSS 20.0 软件，符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用成组资料t检验；非正态分布的计量资料比较采用K检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝纤维化病理表现 正常肝脏中可见清晰的肝小叶结构（图1A），肝组织纹理均匀，仅在汇管区有少量胶原纤维沉积。随着纤维化加剧，中央静脉周围胶原纤维开始增多，间质细胞增多，肝细胞发生脂变，并发生再生，炎症细胞逐渐集中在钙化处，有一定的钙盐沉积现象，肝纤维化程度逐渐增加（图1B～E）。肝纤维化逆转过程中可以观察到纤维隔逐渐减少，胶原逐渐变细，呈断续形态，肝纤维化程度随逆转时间增加逐渐下降（图1F～I）。正常组胶原纤维仅少量存在于汇管区周围且比较纤细。实验组中，随着CCl4诱导肝纤维化的发展，胶原纤维向肝实质内不断延伸，肝小叶结构遭到破坏，胶原变粗，胶原纤维大量沉积在增生的脉管周围，停止诱导后，胶原纤维逐渐被降解而变细，肝细胞出现再生。

图1 肝纤维化发展及逆转不同时期天狼星红病理切片及胶原面积比的比较。正常肝脏无胶原沉积出现（×40，A）；造模8、14、21、42 d肝脏病理镜下示胶原沉积随时间不断增加（×40，B～E）；逆转8、18、35、45 d肝脏病理镜下示胶原沉积开始逐渐减少（×40，F～I）；J为不同时期胶原面积比的比较

为了定量表征胶原纤维随着肝纤维化程度的动态变化，对不同组别的切片进行胶原面积比分析（图1J），结果显示正常组胶原面积比为（0.12±0.04）%，造模8 d、14 d、21 d、42 d 胶原面积比逐渐升高，分别为（0.51±0.20）%、（1.28±0.07）%、（1.73±0.21）%、（3.35±0.87）%；而逆转8 d、18 d、35 d、45 d 胶原沉积情况减轻，胶原面积比逐渐减少，分别为（2.77±0.49）%、（2.13±0.60）%、（1.65±0.17）%、（1.16±0.17）%。逆转45 d 时胶原面积比未降低到正常水平。造模42 d 和逆转8 d、逆转8 d 和逆转18 d胶原面积比差异无统计学意义（P＞0.05），其余不同组间胶原面积比差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 肝脏表面纹理分析 肝纤维化样本受胶原增生的影响，肝脏除血管发生形态学改变及血管数量改变外，肝脏表面也表现为粗糙不平，呈现波浪状或花边状（图2）。

图3为肝纤维发展及逆转过程中样品DEI 感兴趣区图像。随着病变加剧，肝脏表面逐渐粗糙不均匀，有明显凹凸不平现象，其中，造模42 d 凸起之间出现沟壑最明显，界限清晰。随着肝纤维化逆转，肝脏表面粗糙程度下降，表面凹凸不平现象逐渐改善。利用灰度共生矩阵对肝脏表面进行分析，定量结果见图4，正常、纤维化、逆转样品的纹理特征参数惯量、逆差矩、差的均值及差的熵等均有显著差异（表1）。从正常样品到造模8 d、14 d、21 d、42 d 样品，逆差矩值逐渐变小，惯量、差的均值及差的熵均逐渐变大，从造模42 d 到逆转8 d、18 d、35 d、45 d，逆差矩值逐渐变大，惯量、差的均值及差的熵均逐渐变小。正常组和造模8 d、逆转35 d 和逆转45 d组间差异无统计学意义（P＞0.05），其他各组间灰度共生矩阵数值差异均有统计学意义（P＜0.05），纹理特征分析结果与DEI 图像直观纹理观察一致。

图2 肝纤维发展及逆转不同时间DEI 图像。正常肝脏示肝组织纹理结构均匀，血管壁光滑，走行自然，血管树状结构清晰，分支清楚有层次，血管由粗渐细结构匀称（A）；造模8 d DEI 显示组织纹理结构改变不明显，但血管的变形清晰可见（B）；造模14 d、21 d 可见组织纹理结构粗糙，血管形变清晰，小血管的膨胀或收缩变化尤为显著（C、D）；造模42 d 图像呈极不规则的纹理结构，大血管和小血管的变形均更加明显（E）；逆转8、18、35、45 d 肝脏示纹理逐渐清晰，血管变形程度不断减轻（F～I）

图3 肝纤维化发展及逆转不同时间点肝脏表面纹理。正常肝脏表面光滑（A）；造模8、14、21、42 d肝脏，随着病变加剧，肝脏表面逐渐粗糙不均匀（B～E）；逆转8、18、35、45 d肝脏，肝脏表面随着逆转变得逐渐光滑均匀（F～I）

3 讨论

肝纤维化的发展和逆转均是动态的，整个过程中伴随胶原纤维沉积和降解、微血管数量增多和减少、血管形态扭曲和缓解等[10-11]。目前，临床上观察肝纤维化的“金标准”是病理切片分析，如通过狼红染色可以清晰地观察胶原沉积情况，但对于肝脏表面病理仅能显示线状轮廓。临床常用的影像学方法可以实现肝脏成像，但是由于分辨率等局限性，很难观察到肝纤维化的微观病变[12-13]。DEI基于相位信息的改变进行成像，可以显示肝脏组织的微观结构。另外，结合计算机辅助图像分析，利用相应指标可以对肝脏内病变进行定量评估。

在肝纤维化发展过程中，肝脏内部最明显的改变是胶原沉积。通过病理切片观察发现，随着肝纤维化的发展，胶原面积比增大，并逐渐分割肝小叶形成假小叶结构。逆转后，胶原面积下降，胶原纤维开始降解并表现出断续的状态，但无法恢复到正常状态。胶原纤维的改变对肝脏表面的形变会产生比较大的影响，肝实质被增生的胶原挤压，牵拉肝脏表面使其变得凹凸不平。肝脏表面粗糙程度随着肝纤维化发展和逆转发生巨大变化，正常肝脏表面光滑，随着肝纤维化发展，肝脏表面呈现结节状起伏，与正常组织有明显区别，发生逆转后表皮粗糙程度改善，最终恢复到接近中度纤维化的状态。纹理分析结果表明，肝纤维化发展及逆转不同阶段的肝脏表皮的粗糙程度有显著差异，肝脏表面的粗糙程度与肝纤维化的发展关系紧密，可作为肝纤维化发展程度的潜在评价指标。

图4 各组肝纤维化样品惯量、逆差矩、差的均值、差的熵随疾病进程的变化趋势

表1 各组肝表面纹理特征参数（±s）

表1 各组肝表面纹理特征参数（±s）

组别只数惯量逆差矩差的均值差的熵正常组 6 1.4416±0.1594 0.6187±0.0334 0.8735±0.0801 0.7815±0.0369造模组6造模8 d 1.5854±0.2623 0.6032±0.0251 0.9216±0.0822 0.8124±0.0679 0.8696±0.0760造模21 d 2.1937±0.4016 0.5454±0.0278 1.1150±0.1084 0.9480±0.0786造模14 d 1.8312±0.3311 0.5762±0.0249 1.0061±0.0926 1.2480±0.0933逆转组 6造模42 d 4.1962±0.7984 0.4480±0.0269 1.5642±0.1487 1.1262±0.0620逆转18 d 2.6246±0.6807 0.5145±0.0374 1.2335±0.1633 1.0241±0.1068逆转8 d 3.2154±0.4170 0.4827±0.0233 1.3741±0.1005 0.9190±0.1127逆转45 d 1.8235±0.6248 0.5834±0.0592 0.9916±0.1967 0.8522±0.1556逆转35 d 2.0946±0.5609 0.5611±0.0349 1.0697±0.1395

本研究重点利用DEI 技术，以病理切片为辅助手段，对肝纤维化发展和逆转过程中的胶原面积和表面形态进行动态观察，为肝纤维化病变特点提供了更加全面的认识。然而，本研究也存在一定的局限性，实验样品是小鼠离体组织，如果使用活体组织则能更接近生理状态。尽管对实验结果进行分析后发现，肝脏表面粗糙程度和胶原纤维沉积状态呈相同的发展趋势，但肝脏表面变化和胶原增生之间的相互作用机制有待进一步深入研究。

总之，本研究基于CCl4肝纤维化模型，在不加造影剂的情况下，利用DEI 清楚地展现了肝纤维化正常、发展及逆转不同时期的病理变化，并对肝脏表面纹理变化和粗糙程度进行相应的定量分析。因此，DEI可以作为评估肝纤维化程度的一种新方法，有望在肝脏疾病的早期诊断和治疗中发挥重要作用。