基于神经网络模型评价淫羊藿女贞子配伍对大鼠心肺衰老的影响

马紫童，王雪帆，唐秀凤，高莹莹，王 瀚，刘仁慧,2*

（1.首都医科大学中医药学院，北京 100069；2.中医络病研究北京市重点实验室，北京 100069）

随着时代的发展，人口老龄化的趋势日益明显[1-2]。延缓衰老以减轻慢性疾病的发病在人口日益老龄化的社会，具有重要的意义[3]。衰老自由基学说（free radical theory of aging，FRTA）是现代医学阐述衰老发病机制的一个重要学说，认为人体在生理活动过程中一定会产生自由基，自由基连锁反应导致膜损伤和生物分子交联，损害蛋白质、DNA 等，并且损伤的蛋白质、DNA 逐渐累积，诱发有关的老年性疾病[4]。中医认为衰老的机制与五脏虚亏关系密切，尤其是肾虚一直居于主导地位[5-6]。淫羊藿、女贞子是常用的延缓衰老的补肾中药，二者配伍是国家级名老中医李世增教授积50 余年的临床经验总结的常用于延缓衰老的药对。前期实验研究表明，淫羊藿和女贞子配伍对于慢性衰老相关疾病骨质疏松及慢性肺部疾病哮喘均有显著疗效[7-8]。本研究基于上述认识，选择自然衰老大鼠模型，通过检测心、肺组织的病理改变及自由基水平的改变，结合神经网络模型评价药物的综合作用，探讨中药淫羊藿和女贞子单用及配伍对心肺组织衰老的作用。

1 实验材料

SPF 级3 月龄（8 只）、6 月龄组（8 只）、8 月龄（56 只）健康雄性SD 大鼠，由北京维通利华实验动物技术股份有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2016-0006，动物伦理号：AEEI-2016-178。电动匀浆机（上海精密仪器仪表有限公司）；SpectraMax Plus 385 全波长酶标仪（Molecular Devices）；全自动生化仪（日本奥林巴斯株式会社，型号：AU480）；尼康（Nikon）ECLIPSE 80i 生物显微镜及NIS-Elements BR 3.2 图像分析软件（北京锐驰恒业仪器科技有限公司）。总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）检测试剂盒（货号：A015-1）、一氧化氮（Nitric oxide，NO）测定试剂盒（货号：A013-2）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒（货号：A003-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒（货号：A001-3）均购于南京建成生物工程研究所；中药材炙淫羊藿及中药材酒女贞子购于北京同仁堂药店。

2 方法

2.1 分组及给药 8 月龄大鼠随机分为7 组，包括9月龄组、12 月龄组、15 月龄组、17 月龄组，淫羊藿、女贞子组（配伍组）、淫羊藿组、女贞子组，每组8 只。SPF 级3 月龄（8 只）、6 月龄（8 只）作为青年对照组。17 月龄组、淫羊藿组、女贞子组、配伍组正常饲养至15 月龄后分别给予等体积的蒸馏水、淫羊藿煎剂2 g/kg、女贞子煎剂1.5 g/kg、淫羊藿、女贞子煎剂3.5 g/kg（相当于临床等效剂量）灌胃，连续2 个月。

2.2 标本采集与检测 3、6 月龄组大鼠购买后适应环境1 周后处死；9、12、15、17 月龄组饲养至相应月龄后处死；各给药组饲养至17 月龄后处死。禁食16 h后，称重。腹腔麻醉后，剖取心肺组织，称重，计算脏器指数，脏器指数=脏器质量（g）/体质量（g）；每组取7 只样本，固定于10% 甲醛溶液内，进行组织HE 染色切片，每张切片在200 倍镜下选取3 个不同的视野进行测量病理学参数，计算平均值。肺组织病理学参数：参照文献[9]计算标准化气道总管壁厚度（Wat）和标准化平滑肌厚度（Wam）。心组织病理学参数：参考文献[10]测量间隙宽度，计算心肌纤维间隙和心肌细胞面积百分比。制备10%心肺组织匀浆，采用考马斯亮蓝法测定匀浆上清中蛋白含量；微板法测定组织NO 水平；比色法测定组织T-AOC 水平；WST-1 法测定组织SOD 水平；TBA 法测定组织MDA 水平。以上检测均按照测试盒说明书进行。

2.3 统计学方法 采用SPSS 18.0 for Windows 软件包完成，数据采用均数 ± 标准差（）表示，组间比较采用方差齐性检验及单因素方差分析，根据方差齐性检验结果选择LSD（方差齐）或Tamhane’s T2（方差不齐）。综合分析采用多层感知神经网络分析。

3 结果

3.1 大鼠肺脏指数及病理的增龄性改变及淫羊藿、女贞子对其的影响 见表1、表2、图1。与3月龄大鼠比较，其余各月龄组肺脏指数显著降低（P＜0.05 或0.01）；此外，12 月龄组肺脏指数较6 月龄组显著降低（P＜0.05）。分别与3、6 月龄青年大鼠比较，12、15、17月龄组大鼠肺脏病理参数Wat及Wam均显著升高（P＜0.05 或0.01）。与17 月龄衰老大鼠比较，淫羊藿组和配伍组Wat 及Wam 均显著降低（均P＜0.01），且配伍组与女贞子单用组比较有统计学差异（均P＜0.05）。

表1 不同月龄组大鼠肺脏指数及病理学的比较（）

表1 不同月龄组大鼠肺脏指数及病理学的比较（）

注：与3 月龄组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01；与6 月龄组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与9 月龄组比较，▲P ＜0.05肺脏指数：n=8；肺脏病理参数：n=7

3.2 大鼠肺脏T-AOC、SOD、MDA 和NO 的增龄性改变及淫羊藿、女贞子对其的影响 见表3、表4。不同年龄组大鼠肺脏T-AOC、SOD、NO 水平在6 月龄组达到峰值，之后随着月龄的增加而逐渐降低（均P＜0.01）；MDA 水平在6 月龄最低，之后随着月龄的增加而逐渐升高（均P＜0.01）。与17 月龄老年大鼠比较，各用药组大鼠肺组织T-AOC水平均显著升高（均P＜0.01）。此外，配伍组肺组织T-AOC 水平较淫羊藿组降低（P＜0.01）。

表2 淫羊藿女贞子对衰老大鼠肺脏指数及病理学的影响（）

表2 淫羊藿女贞子对衰老大鼠肺脏指数及病理学的影响（）

注：与17 月龄组比较，## P ＜0.01；与配伍组比较，△P ＜0.05肺脏指数：n=8；肺脏病理参数：n=7

图1 各组大鼠肺脏病理HE 染色照片（×200）

表3 不同月龄大鼠肺脏T-AOC、SOD、MDA 和NO 的比较（，n=8）

表3 不同月龄大鼠肺脏T-AOC、SOD、MDA 和NO 的比较（，n=8）

注：与3 月龄组比较，## P ＜0.01；与6 月龄组比较，△△P ＜0.01；与9 月龄组比较，▲▲P ＜0.01；与12 月龄组比较，□□P ＜0.01；与15 月龄组比较，■■P ＜0.01

表4 淫羊藿女贞子对衰老大鼠肺脏T-AOC、SOD、MDA 和NO 的影响（，n=8）

表4 淫羊藿女贞子对衰老大鼠肺脏T-AOC、SOD、MDA 和NO 的影响（，n=8）

注：与17 月龄组比较，## P ＜0.01；与配伍组比较，△△P ＜0.01

3.3 大鼠心脏指数及病理的增龄性改变及淫羊藿女贞子的影响 见表5、表6、图2。

表5 不同月龄组大鼠心脏指数及病理参数的比较（）

表5 不同月龄组大鼠心脏指数及病理参数的比较（）

注：与3 月龄组比较，## P ＜0.01；与6 月龄组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。心脏指数：n=8；心脏病理参数：n=7

与3 月龄组比较，除6 月龄组外各组心脏指数均显著降低（均P＜0.01），各组心肌纤维间隙均增加，但心肌细胞面积百分比降低（均P＜0.01）。与6 月龄组比较，9 月龄之后各组心脏指数降低（P＜0.05或0.01），心肌纤维间隙均显著增加（均P＜0.01）。与17 月龄衰老大鼠比较，配伍组心脏指数及心肌细胞面积有显著性差异（均P＜0.01）；各给药组的心肌纤维间隙显著降低（均P＜0.01）。与淫羊藿组比较，配伍组能显著降低心肌纤维间隙，并增加心肌细胞面积（P＜0.05 或0.01）。

表6 淫羊藿女贞子对衰老大鼠心脏指数及病理参数的影响（）

表6 淫羊藿女贞子对衰老大鼠心脏指数及病理参数的影响（）

注：与17 月龄组比较，## P ＜0.01；与配伍组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。心脏指数：n=8；心脏病理参数：n=7

图2 各组大鼠心脏病理HE 染色照片（×200）

3.4 大鼠心脏T-AOC、SOD、MDA 和NO 的增龄性改变及淫羊藿、女贞子对其的影响 见表7、表8。大鼠心脏T-AOC、SOD 水平在6 月龄组达到峰值，之后随着月龄的增加而逐渐降低（均P＜0.01）；MDA 水平在6 月龄最低，之后随着月龄的增加而逐渐升高（均P＜ 0.01）；NO 水平在9 月龄达到峰值，之后随着月龄的增加而逐渐降低（均P＜0.01）。与17 月龄老年大鼠比较，各用药组对心脏T-AOC、SOD、MDA 和NO 水平均无显著影响。

3.5 基于神经网络模型评价淫羊藿、女贞子对大鼠心肺衰老的综合作用 对6 个不同月龄组的14 项检测指标应用多层感知（multi-layer perceptron，MLP）神经网络分析，其中训练样本34，测试样本14 个，得到的模型训练样本相对错误预测0.9%，测试样本相对错误预测1.6%。利用此模型对给药各组样本的14 项数据进行预测。与17 月龄组的预测值（16.84 ± 0.18）月比较，配伍组预测值（11.82 ± 1.14）月显著降低（P＜0.01）。与配伍组比较，淫羊藿组预测值（15.41±0.38）、女贞子预测值（14.98±0.46）具有显著性差异（均P＜0.01）。根据输入指标对网络的影响程度，见图3。可知肺脏MDA、心肌纤维间隙、心脏SOD、心脏MDA等指标是本神经网络模型中较为重要的影响因素。

表7 不同月龄大鼠心脏T-AOC、SOD、MDA 和NO 的比较（，n=8）

表7 不同月龄大鼠心脏T-AOC、SOD、MDA 和NO 的比较（，n=8）

注：与3 月龄组比较，## P ＜0.01；与6 月龄组比较，△△P ＜0.01；与9 月龄组比较，▲▲P ＜0.01；与12 月龄组比较，□□P ＜0.01；与15 月龄组比较，■■P ＜0.01

表8 淫羊藿女贞子对衰老大鼠心脏T-AOC、SOD、MDA 和NO 的影响（，n=8）

表8 淫羊藿女贞子对衰老大鼠心脏T-AOC、SOD、MDA 和NO 的影响（，n=8）

图3 MLP 输入变量的重要性分析

4 讨论

自由基[11]是机体内一类独立存在、含活泼不成对电子的特殊物质，是机体生命活动中各种生化反应的中间代谢产物。机体防御系统具有高度化学活性，正常情况下，机体中各种抗氧化酶和小分子非酶抗氧化剂与自由基的产生处于动态平衡状态，但随着年龄增长，自由基过剩或抗氧化剂缺乏等使生物膜结构遭到破坏、细胞器功能出现障碍，继而损伤蛋白质、脂质等生物大分子物质。衰老的自由基学说[12]认为，在机体代谢过程中，自由基水平的增加或抗氧化剂的缺失使机体抗氧化能力下降和细胞毒性增加，最终造成不可逆的损伤[13]。

祖国医学则认为五脏皆虚是衰老之本[14]。心肺同居上焦。肺主气，随着年龄的增长，肺气不足则导致机体气机的紊乱，影响气血津液的分布，从而使机体失养，堆积痰、瘀、毒等病理产物而加速衰老[15]。心主血脉，心血瘀阻可导致衰老，且衰老时心气不足，心神失养，则五脏六腑功能都会受到影响，脏腑日渐衰退，最终导致衰老或加重衰老的进程[16]。本实验通过HE 染色不同月龄大鼠心肺组织，发现肺组织中支气管壁及平滑肌厚度随年龄增加而增加，提示通气阻力加大，肺主呼吸的功能受影响；心脏中心肌纤维间隙随年龄增加而增大，心肌细胞面积百分比随年龄增加而降低，提示心功能出现增龄性的减退。同时自然衰老大鼠心肺组织中自由基水平随着年龄的增长而逐渐增加，抗氧化能力却逐渐降低，提示自由基损伤可能是导致心肺功能降低的一个重要原因。

肾为先天之本，人体生长、发育、衰老至死亡的过程就是肾气逐渐充实、隆盛、亏虚乃至衰竭的过程[17]，故补肾是中医延缓衰老的主要方法。淫羊藿具有补肾阳的功效，研究表明其延缓衰老的作用与抗氧化、降脂、调节免疫、改善学习记忆能力，提高心血管功能及生殖功能等有关[18-19]；女贞子具有滋补肝肾之阴的功效，研究表明其延缓衰老的作用与抗氧化、护肝、抗炎、降脂、调节免疫、抗骨质疏松等药理作用有关[20-21]。淫羊藿、女贞子配伍可平补肾中阴阳，是国家级名老中医李世增教授常用于治疗衰老相关疾病的基本药对组合，李老认为二药可通过滋养肾精，调节脏腑气血而达到延缓衰老的作用。

本研究采用自然衰老大鼠模型，探讨补肾中药对自然衰老大鼠心肺组织退行性病理改变及氧化损伤的作用。结果证实淫羊藿、女贞子配伍能显著改善老年大鼠心、肺组织退行性的病理改变，且对肺组织病理的改善作用优于女贞子单用，而对心脏病理改善作用优于淫羊藿单用。此外，二者配伍可以显著增加肺内T-AOC 水平，但对肺内SOD、MDA、NO 水平均无明显作用，对心脏MDA、SOD、T-AOC、NO 无明显作用。基于神经网络模型综合评价了淫羊藿、女贞子单用及配伍的作用，证实配伍组对心肺衰老改变的作用优于淫羊藿、女贞子的单用。淫羊藿、女贞子均主归肝肾二经，肾属水，为气之根，金水相生；水火既济，心肾通过复杂的生理病理机制相互影响，相互作用；肝属木，木生火；肝肺生理相关，病理相连。淫羊藿、女贞子配伍可能通过补肾、调节肝的功能以延缓心肺二脏衰老，但对心肺病理学的改善作用与抗氧化作用关系并不密切，可能通过其他的途径，有待于进一步研究。