含CC31 毕赤酵母工程菌固态发酵生产蛋白质饲料的效果

张萌萌，李天阳，姜宁，张爱忠

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院/黑龙江省寒区饲料资源高效利用与营养调控重点实验室，大庆 163319）

随着抗生素的禁用以及蛋白质饲料的紧缺，寻找新的抗生素替代品以及开发新的蛋白质饲料生产方式成为研究的热点，利用微生物进行饲料的发酵可以产生较多的微生物代谢小分子以及高蛋白产品[1]。固态发酵就是一种常用的微生物生产高蛋白饲料的手段[2]。原料经过微生物进行的固态发酵后，其含有的多糖类化合物、脂肪、蛋白质等一些大分子物质代谢为可以直接吸收运用的小分子物质，同时可以在一定程度上降低原料中抗营养因子含量，使发酵后的原料更易被动物机体消化和吸收[3]。刘纪成等[4]采用复合菌剂以花生秸秆为底料进行固态发酵发现粗蛋白含量提高了53.39%，粗灰分和粗纤维分别降低了20.10%和57.97%。张仲卿等[5]在简单破碎的玉米秸秆上接种混合真菌后发现纤维素和木质素含量普遍下降，分别降低了36.80%和28.87%。申春莉等[6]利用灵芝菌丝发酵豆渣发现可溶性蛋白和氨基酸态氮由发酵前 2.03 mg·g-1和 1.16 mg·g-1显著上升到11.01 mg·g-1和 9.88 mg·g-1。固态发酵还可以生产生物活性次级代谢产物，例如：激素、生物碱、酶等[7]。刘潇等[8]使用枯草芽孢杆菌进行固态发酵后经过检测发现核桃粕多肽含量可达243.97 mg·g-1。钱静亚等[9]采用米曲霉进行固态发酵后检测到极具活性的木质素降解酶，其含量可以达到2.08 U·g-1ds。

近些年来，利用酵母菌进行固态发酵改善饲料品质的研究已有较多的报道，Mandal 等[10]利用鱼肠中分离的毕赤酵母菌（GU939629）进行固态发酵单宁酶含量可达0.82±0.024 U·g-1ds，单宁含量降低94.10%。孙宏等[11]利用酿酒酵母进行固态发酵后经检测发现原料中粗蛋白、总酚、维生素B2和低分子量肽含量显著提高。虽有较多的研究证实酵母菌具有改善饲料品质的功能，但其发酵底物和发酵的工艺不尽相同，致使产品的质量各不相同，使用效果参差不齐，生产上的差异严重制约了酵母类添加剂的推广和实际的应用。因此，试验选用含抗菌肽CC31 毕赤酵母工程菌为试验菌种，以豆粕和麦麸为发酵底物，以小分子蛋白质为评价指数进行固态发酵工艺进行优化，同时拟合小分子蛋白浓度（Y）与接种量（X1）、含水量（X2）的方程，以期为酵母菌进行固态发酵生产高功能性蛋白含量的饲料提供合理的技术参数。

1 材料与方法

1.1 发酵原料和菌种

豆粕、麦麸均购自黑龙江大庆市大庆禾丰八一农大动物科技有限公司。

含抗菌肽CC31 巴斯德毕赤酵母重组工程菌为黑龙江八一农垦大学动物营养研究所保存。根据杂合抗菌肽的分子设计原理，实验室利用家蝇抗菌肽Cec Md 和林蛙抗菌肽Chensirin 的序列作为亲本肽序列，通过消减和替换的方式设计了具有抗菌潜力的杂合肽CC31[12]，通过巴斯德毕赤酵母工程菌进行表达，得到含抗菌肽CC31 巴斯德毕赤酵母重组工程菌。

1.2 培养基

优化后 BSM 培养基：85% H3PO426.7 ml·L-1、CaSO4·2H2O 0.94 g·L-1、K2SO418.2 g·L-1、KOH 4.13 g·L-1、MgSO4·2H2O 14.9 g·L-1、甘油 30 g·L-1、葡萄糖 30 g·L-1、（NH4）2SO415 g·L-1、酵母浸出物 10 g·L-1。

1.3 固态发酵饲料的制备

1.3.1 毕赤酵母种子菌液制备

将含抗菌肽CC31 酵母重组工程菌划线YPD 固体平板（含 Zeocin 50 μg·mL-1），30 ℃恒温培养。选取单一的菌落接种到50 mL 优化BSM 液体培养基，30 ℃，200 rpm 震荡培养54 h。将上述种子液按照10%的量转接于新的含有500 mL 优化BSM 液体培养基的 2 L 摇瓶中，30 ℃，200 rpm·min-1震荡培养42 h 作为种子液。

1.3.2 筛选最佳发酵底物粒度

取180 g 豆粕与20 g 麦麸，粒度水平分别为40～60 目、60～80 目、80 目以上，加入等量灭菌蒸馏水，再加入等量发酵菌液，充分混合均匀，维持pH 自然值，将袋中充满空气，每个水平重复3 次，每天（0～8 d）每个水平随机抽取3 袋，测定小蛋白菌体浓度，确定最佳发酵粒度。

1.3.3 筛选最佳接种量和含水量

在最佳发酵粒度的基础上，采用均匀试验设计（表1、表2）筛选接种量和含水量，利用DPSV7.05 软件对数据进行多元二次逐步回归分析。

表1 因素水平表Table 1 The factor and level table of uniform design

表2 试验表Table 2 The test table of uniform design

1.4 测定指标与方法

1.4.1 小分子蛋白含量的测定

利用真空冷冻干燥机（Delta1-24LSC，德国Christ）冻干发酵豆粕，置于组织粉碎机（LMLW-320/2 型，荷兰Laarmann）充分粉碎。称取2 g 样品振荡混合于40 mL PBS，静置过夜，3 000 r·min-1离心 30 min，取离心后的上清液转移100 000 滤管，再次进行5 000 r·min-1离心2 h，弃上清液，剩余部分转移30 000 滤管后再次进行 5 000 r·min-1离心 2 h，弃上清液，然后使用碧云天BCA 蛋白浓度测定试剂盒对其蛋白含量进行测定，具体步骤参照试剂盒使用说明。

1.4.2 回归方程建立

以接种量（X1）、含水量（X2）为自变量，并通过固态发酵试验测定所得发酵产物中的小分子蛋白浓度（Y）为因变量，建立回归方程。

1.4.3 Tricine-SDS-PAGE 检测

将65%硫酸铵溶液等体积加入上述超滤后的菌液中低温搅拌使蛋白充分沉淀，低温4 ℃下进行4 000 r·min-1离心10 min，取沉淀后进行Tricine-SDS-PAGE 检测。

1.4.4 粗蛋白、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量测定

粗蛋白（CP） 含量测定使用凯氏定氮法（GB5511-85），参照Van Soest 分析体系中提供的方法采用纤维分析仪（ANKOM 200/220，美国）测定中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）的含量[13]。

2 结果分析

2.1 发酵粒度的筛选

随着发酵时间的延长，发酵后的豆粕中小分子蛋白浓度逐渐提高（图1），后期趋于平稳。选用的40～60 目发酵底物在前5 d 时蛋白浓度迅速提高，其增加速度高于其他目数底物；60～80 目发酵底物蛋白浓度提高较为缓慢，后期趋于平稳；80 目以上发酵底物在前5 d 蛋白浓度提高较快，但后期处于下降状态，逐渐低于40～60 目发酵底物蛋白浓度。通过发酵时间和蛋白浓度含量进行综合分析都得出40～60 目可以最为最佳发酵粒度。

图1 粒度对蛋白浓度的影响Fig 1 Effect of particle size on protein concentration

2.2 含水量和接种量条件的筛选与回归模型的建立

通过对接种量和含水量的筛选优化，测得蛋白浓度如表3 所示。

接种量（X1）和含水量（X2）为自变量，测得发酵产物中蛋白浓度（Y），拟合回归曲线。采用DPSV7.05 软件均匀设计模块对结果进行多元二次回归分析，得到回归模型为：

R2=0.99，F 值为 31.69，P 值为 0.13，得出回归方程线性关系良好。利用所得公式预测接种量为9.85%，含水量为51.22%，小分子蛋白浓度可以达到最高为 148.99 mg·L-1。

表3 均匀试验设计方案及结果Table 3 The scheme and the results of uniform design

2.3 拟合曲线的验证和小分子蛋白Tricine-SDSPAGE

依据拟合曲线最优含水量和接种量为参考，选用10%的接种量，50%的含水量时，分别重复3 次试验，检测后得到小分子蛋白浓度可达156.23 mg·L-1，与预测值相比较发现误差仅为4.63%，说明建立的拟合曲线预测发酵结果。对浓缩后的小分子蛋白进行Tricine-SDS-PAGE 验证，图2 显示蛋白条带与目的蛋白条带相吻合，发酵产生的蛋白产物包含所需要的抗菌肽CC31，且含量相对较高，通过固态发酵可以为抗菌肽的开发运用提供新的有效途径。

图2 CC31 分子分离效果的Tricine-SDS-PAGEFig.2 The analysis of Tricine-SDS-PAGE for CC31

2.4 发酵后 CP、NDF 和 ADF 变化

通过与原料相比较，发酵后CP 含量得到明显的提高，NDF 和ADF 含量的变化幅度较小，说明含抗菌肽CC31 毕赤酵母工程菌进行固态发酵主要改变蛋白含量，对NDF 和ADF 含量影响较低。

表4 毕赤酵母菌对发酵豆粕营养的影响（干物质基础）Table 4 Effect of pichia pastoris on the nutrition of fermented soybean meal（dry matter basis）

2.5 毕赤酵母固态发酵的豆粕形态

通过拟合曲线进行优化，发酵后形态如图3。与原料相比，发酵后的豆粕色泽暗黄，颗粒感更加明显，颗粒度远大于原料豆粕，手感较为滑腻，质地较软，有一定的弹性，气味为一股微酸豆味，同时含有酵母菌味。

图3 发酵豆粕形态（左侧为毕赤酵母发酵料 右侧为原料）Fig.3 The morphology of fermented soybean meal

3 讨论

3.1 发酵粒度对发酵品质的影响

目前固态发酵的影响因素探究主要集中在温度、水分等条件，对发酵底物颗粒的大小研究的相对较少。Farinas[14]在固态发酵使用中指出底物或载体的选用应着重考虑原料的成本以及可用性，同时其他特性如颗粒大小等也应作为重点的选择。原料颗粒的大小关系到发酵菌种与发酵空间中氧气的结合程度，较小底物颗粒的累积容易造成发酵原料内氧含量的降低，需要靠通风或搅拌提高基质内氧气的含量，但搅拌和翻动次数的增加，极易损伤菌丝，加速基质内水分的流失，导致菌体生长受限甚至死亡；底物颗粒较大使基质内留有足够的间隙，原料与空气的接触度相对增加，但容易造成发酵不完全，发酵后颗粒硬度大[15]。管军军等[16]研究得出发酵底物粒度的增加可以增加基质内间隙，但发酵后底物硬度相对增加；而细小粒度底物发酵后颗粒硬度降低，由于原料间隙相对较小互相堆积，造成发酵后底物整体体积收缩。合适的发酵粒度有助于得到更好的发酵产物。试验表明，40～60 目的豆粕底物发酵品质优于其他目数，说明40～60 目发酵料能满足酵母菌在发酵过程中的需氧量，较好的完成发酵的过程。

3.2 接种量和含水量对发酵品质的影响

接种量与含水量的配比可以直接决定发酵底物的品质。合适的接种量可以加速基质内菌种的生长与繁殖，加快发酵的进行，防止杂菌的污染，提高底物中蛋白质的含量。底物含水量是进行发酵的决定性因素，直接影响微生物的生长速度及其代谢能力。较高的含水量将造成底物气体流通性降低，底物颗粒产生板结，同时易滋生杂菌影响发酵品质；较低的含水量，底物吸水程度受限，膨胀度下降，营养物质供给受到限制，菌体生长与繁殖受到抑制[17]。因此，选择恰当的接种量与含水量在一定程度上可以改善发酵的品质和发酵的效率。试验得出，选用毕赤酵母工程菌作为发酵菌株，在底物50%的含水量，10%的接种量情况下进行固态发酵，发酵产物中小分子蛋白含量可以达到 156 mg·L-1。Chi 等[18]研究得出，选用合适的发酵菌种和发酵条件在一定程度上可以提高发酵后豆粕中生物活性物质。吴正可等[19]通过正交试验优化固态发酵的温度、含水量以及接种量后发现，嗜酸乳杆菌和酿酒酵母和枯草芽孢杆菌（比例1∶3∶2）的复合菌进行菜籽粕固态发酵，可以有效降解菜籽粕硫甙含量，提高多肽和总酸含量，改善其营养价值。张佳斌等[20]研究得出发酵底物的所处温度、菌种的接种量以及底物含水量可以直接决定枯草芽孢杆菌发酵豆粕的品质。在合适的菌种条件下，优化发酵的温度、含水量以及接种量可以直接提高发酵底物营养成分的含量，降低抗营养因子的水平，改善饲料的品质，提高其适口性。

3.3 发酵前后原料品质的变化

豆粕因较高的蛋白质和多糖等营养成分，被畜牧行业广泛的用作各种动物的蛋白饲料原料，但较高含量的抗营养因子也限制了豆粕营养的利用程度。经研究发现利用微生物的分解和转化能力可以消除豆粕中大部分的抗营养因子，生成被动物直接吸收利用的可溶性多肽、未知的促生长因子等一系列物质[21]。吝常华等[22]利用单菌（解淀粉芽孢杆菌）和混菌（解淀粉芽孢杆菌∶植物乳杆菌∶酿酒酵母=9∶3∶2）固态发酵豆粕，发现明显提高小肽、粗蛋白、粗灰分、粗脂肪含量，在一定程度上可以改善豆粕的品质。罗远琴等[23]研究发现枯草芽孢杆菌、酿酒酵母及其复合菌发酵棉粕发现酸溶蛋白、棉籽肽以及总游离氨基酸含量得到提高，显著改善棉粕的营养价值，复合菌发酵后有浓郁的酒香味，在一定程度上更能提高其适口性。于新颖等[24]研究发现粗壮脉纹孢菌进行菜籽粕固态发酵粗蛋白、可溶性蛋白、氨基酸和类胡萝卜素含量均呈现上升趋势，粗纤维、单宁、植酸以及硫甙含量呈现下降趋势，有效解决了菜籽粕未经处理用于饲料原料的安全问题。Taliercio 等[25]和Kim[26]的研究指出发酵后的豆粕在一定限度上可以有效降低致敏性，降低对动物的危害。试验结果表明，通过固态发酵可以提高豆粕原料的蛋白质含量，发酵后质地更加柔软，且伴随一定的弹性，气味为一股微酸豆味，更容易被畜禽所采食，是一种不可多得的生物饲料。

4 结论

（1）含抗菌肽CC31 毕赤酵母工程菌最佳固态发酵的底物颗粒度为40～60 目。

（2）小分子蛋白浓度拟合曲线：Y=113.874 5+0.915 5 X1+1.195 2 X2-0.046 5 X1·X1-0.116 7 X·2X2，R2=0.99，通过曲线预测X1值为9.85%，X2值为51.22%时，小分子蛋白浓度达到最大值（Y）为148.99 mg·L-1。

（3）含抗菌肽CC31 毕赤酵母工程菌进行固态发酵能有效的提高小分子功能性蛋白含量，进而提高饲料原料粗蛋白含量。