年龄差异对家兔CD4+T细胞在胃肠分布的影响

火兴民，李淑贤，王雯慧

(甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070)

作为与外部环境接触最为密切的机体内表面，胃肠道在承担着消化吸收功能的同时，还要时刻警惕来源于机体外部环境的病原菌入侵，当觉察到危险时要迅速地做出反应发动黏膜免疫系统产生免疫保护[1]。在黏膜的免疫保护反应中，T细胞是参与其中的一类重要的免疫细胞[2]，其中T细胞亚群中的CD4+T细胞在维持肠道内部环境的稳定和保护肠黏膜免受致病微生物侵害的过程中发挥主要的作用，这也使得CD4+T细胞在肠道固有层T细胞总数中占比较大，超过了50%以上[3]。T淋巴细胞依照其组成表面抗原受体的2条异二聚体的不同，可以分类为T细胞和T细胞，T细胞依据其表面另一类具有在抗原识别过程中发挥协助功能的分子的差异，进一步被分为CD4+T细胞和CD8+T细胞。CD4+T细胞为辅助性T细胞[4]，CD4分子是单次跨膜的单链糖蛋白，通过与专职摄取加工呈递抗原的细胞外部MHCⅡ类分子特异性结合从而参与到TCR对抗原的识别的过程中[5]。

CD4+T细胞通过分泌细胞因子调节B细胞产生免疫球蛋白，召集白细胞抵达感染和炎症部位，并且调动其他T细胞发挥相应的效应功能，以及促进巨噬细胞的活性等方面发挥积极的作用[6]。有研究表明，当CD4+T细胞在肠内出现大量聚集的状态时，是炎症性肠病(IBD)发生的典型表现之一,这种异常聚集的现象不仅是疾病发生时的组织病理表现，同时也有可能是导致IBD发生的直接原因[7]。CD4+T细胞发挥适度的功能是维持机体健康的前提，自体防御系统发生异常而引发的疾病往往就是因为反应过于剧烈造成的不良后果，反应太弱则会面临感染和炎症的风险[8]。

有学者对人和兔肠黏膜相关淋巴组织(GALT)特征进行了研究比较，发现GALT结构在人与兔之间拥有很高的相似度，因此对兔消化道黏膜免疫的研究可为人医临床中肠相关疾病的研究提供可参考的资料[9]。

1 材料与方法

1.1 实验动物30只白兔市购，按不同年龄归类为幼年组(2月龄)、青年组(6月龄)和老年组(36月龄)，每组5只雌性、5只雄性。

1.2 样本采集使用0.1 mL/kg戊巴比妥钠经耳缘静脉注射后致死白兔，取胃、小肠、大肠并浸泡在固定液中。

1.3 染色切片脱蜡后，依次滴入30% H2O2，0.1% 胰蛋白酶，5% BSA封闭液，一抗Anti-CD4抗体[KEN4](ab194998，Abcam)，二抗驴抗羊IgG(博奥森),SABC试剂，DAB显色液，之后苏木精轻度复染，脱水，透明，封片，观察。

1.4 统计方法从各组各部位染色后的切片中任意挑选5个样本，每个样本随机挑选10个视野，计算单位面积CD4阳性细胞的数目。应用SPSS 17.0统计软件计算，独立样本t检验，P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 CD4+T细胞在胃中的分布特征

2.1.1CD4+T细胞在胃中的定位 大多数CD4+T细胞定位在黏膜肌层周围，胃腺之间偶尔可见分布，但数量较少(图1，2)。

A1.为局部放大后CD4+T细胞在胃底腺区的分布情况，箭头所示为CD4+细胞；A2.阴性对照

B1.为局部放大后CD4+T细胞在幽门腺区的分布情况，箭头所示为CD4+细胞；B2.阴性对照

2.1.2CD4+T细胞在胃中的数量变化 胃底腺区的阳性细胞数目明显少于幽门腺区。各部位的阳性细胞数目随着年龄增长呈现先增后减的趋势(表1，图3)。

表1 胃CD4+ T细胞数量统计

2.2 CD4+T细胞在小肠中的分布特征

2.2.1CD4+T细胞在小肠中的定位 CD4+T细胞的基本形态主要为圆形或椭圆形。CD4+T细胞大多定位于固有层中，且绒毛固有层中分布较多(图4～6)。

图3 胃中CD4+ T细胞数量随年龄变化趋势

C1,C2.CD4+ T细胞在十二指肠肠绒毛不同部位的定位情况，箭头指向的是CD4+细胞；C3,C4.阴性对照

D1,D2.CD4+ T细胞在空肠肠绒毛不同部位的定位情况，箭头指向的是CD4+细胞；D3,D4.阴性对照

E1,E2.CD4+ T细胞在回肠肠绒毛不同部位的定位情况，箭头指向的是CD4+细胞；E3,E4.阴性对照

2.2.2CD4+T细胞在小肠中的数量变化 小肠不同部位CD4+T细胞数目无明显的差异，由十二指肠到回肠表现为小幅递增。小肠各段的阳性细胞数量随年龄的增长表现出先增后减的变化趋势(表2,图7)。

表2 小肠CD4+ T细胞数量统计

图7 小肠CD4+ T细胞数量随年龄变化趋势

2.3 CD4+T细胞在大肠中的分布特征

2.3.1CD4+T细胞在大肠中的定位 CD4+T细胞主要定位于大肠黏膜固有层中(图8～10)。

2.3.2CD4+T细胞在大肠中的数量变化 大肠不同部位CD4+T细胞数量差距不明显，由前段向后段小幅度递减。CD4+T细胞的数量随月龄增加表现为先增后减的变化趋势，而2月龄组与36月组龄未见明显差异(表3,图11)。

F1.阳性细胞在盲肠的定位情况，箭头指向的是CD4+细胞；F2.阴性对照

3 讨论

本试验结果显示，CD4+T细胞在胃底腺区的定位数量要明显低于幽门腺区。胃底腺区有大量的主细胞，由它分泌的盐酸不仅帮助消化食物，而且还可以杀灭随着食物进入到胃中的病原微生物，同时胃酸可以在胃底腺区黏膜表面形成一层屏障，可有效的隔绝病原与黏膜接触。幽门腺区缺乏主细胞，因此是盐酸形成保护屏障的非优势区域，而食物在经过幽门进入小肠时可与黏膜充分接触，增加了黏膜暴露于有害因子中的风险，所以这一区域需要较多数量的CD4+T细胞参与免疫保护反应，这可能是胃底与幽门部CD4+T细胞数量出现差异的原因之一。

G1,G2.CD4+ T细胞在结肠不同部位的定位情况，箭头指向的是CD4+细胞；G3,G4.阴性对照

H1,H2.CD4+ T细胞在回肠肠绒毛不同部位的定位情况，箭头指向的是CD4+细胞；H3,H4.阴性对照

表3 大肠CD4+ T细胞数量统计

CD4+T细胞在肠道中主要分布于固有层中，固有层是T细胞发挥功能的主要部位，效应部位的幼稚T细胞受到抗原刺激后迅速发生分化和增殖，之后转移到固有层等部位参与保护反应，研究中发现阳性细胞尤其在肠绒毛固有层中表现聚集性的分布，这与肠绒毛负责营养物质吸收功能而与肠内容物紧密接触相关，食靡中的病原可能会对绒毛上皮完整性造成破坏，所以有较多的T细胞存在于这一区域及时参与免疫保护。小肠各部分CD4+T细胞分布数量的变化与对大鼠和小鼠的研究结果吻合，均呈现由小肠前段到后段的小幅度递增[10]。在肠道中与宿主共同生活的微生物群落与免疫系统息息相关[11]，它们在免疫系统的发育成熟和功能发挥以及其他调节机体正常生理功能方面起着直接或间接的作用[12]，据此猜测CD4+T细胞在小肠中呈现如此的分布变化可能与定殖于小肠各部分黏膜表面的微生物群落的数量有很大程度的关联，而且年龄、饮食等因素也在影响着微生物群落的构成[13-14]，从而间接影响CD4+T细胞的分布，这也是为什么家兔阳性细胞的分布随年龄变化出现差异的原因之一。有人对肠道中的菌群分布特点进行研究后发现，肠道中大多数的菌群主要定殖于小肠后段和大肠前段，小肠中除了后段以外的其余部分普遍表现出较低的菌群丰度[15]，这一结果更加印证了先前的猜测，微生物群落定殖数量直接影响着CD4+T细胞分布数量。此外，资料证实小肠中巨噬细胞数量的变化趋势由前段到后段表现为逐渐递增，这与CD4+T细胞的分布变化特点相同，这是因为巨噬细胞的活力增强受CD4+T细胞所分泌的细胞因子的调控[16]，因此出现了这种相伴分布的状态。肠道各部位CD4+T细胞数量随年龄增长表现出先增后减的变化趋势，和小鼠GALT增龄性变化相符[17]。目前，生理衰老对CD4+T细胞表型和功能影响的研究有限，但是衰老在肠黏膜上皮屏障完整性缺失的过程中起到了推动作用，同时也是对肠道病原微生物防御能力下降的一个因素，老年动物受此影响，遭受疾病侵扰的风险增加。

图10 大肠CD4+ T细胞数量随年龄变化趋势