乳腺微钙化促进乳腺癌骨转移的研究进展*

沈敏娟， 卫敏佳， 何佳颖， 牛丽娜， 焦 凯△

（1军事口腔医学国家重点实验室，口腔疾病国家临床医学研究中心，陕西省口腔疾病国际联合研究中心，空军军医大学口腔医院黏膜病科，陕西西安710032；2阜阳师范大学教育系，安徽阜阳236037）

乳腺癌是女性发病率最高的癌症，在过去的十年中，全球发病率持续上升，死亡率高居不下。最新的统计学研究表明，仅2018 年，全球范围内检测出约210万乳腺癌病例，其中近63万患者死亡，因而也是女性死亡率最高的癌症［1］。然而，许多癌症患者的死亡并非由于肿瘤在原发部位生长，而是在于肿瘤侵袭或转移至其他部位，其中乳腺癌最容易发生骨转移［2］。在临床上，骨转移常给患者带来极大的痛苦，严重影响患者生活质量。同时，肿瘤一旦转移至骨组织，通常则无法治愈，总体预后差［3］。因此，乳腺癌的早期筛查尤为重要，而乳腺微钙化（micro⁃calcification）是诊断早期乳腺癌的重要特征，也可能是早期乳腺恶性肿瘤的唯一指征［4］。但是，乳腺微钙化作为一种病理性矿化（pathological mineraliza⁃tion）对乳腺癌的发生发展及造成乳腺癌骨转移的机制仍未明确。

因此，本文基于乳腺微钙化和乳腺癌骨转移这两大特征，将分别从乳腺微钙化的形成、微钙化与骨转移的联系及早期诊断与治疗这3 个方面分别进行阐述，以期充分理解微钙化与乳腺癌的发生发展及相关骨转移机制，为乳腺癌的诊断和个体化、精准化治疗策略提供理论支撑。

1 乳腺微钙化的分类

病理性矿化是指在软组织中出现异位钙化或矿化，继而发生一系列严重影响患者健康的疾病，如骨关节炎、肾结石及乳腺癌等［5］。乳腺病理性微钙化是指矿物在乳腺中发生异位沉积，且与乳腺癌的发生相关［6］。近年来，病理性矿化相关疾病的研究集中于矿物特性研究，如矿物的物理化学特征、结晶度、矿物类型等［7］。在乳腺相关病理性矿化疾病领域，矿物上述特征与乳腺癌关系的研究受到广泛关注［8］

乳腺微钙化根据矿物特征主要可分为两类。Ⅰ型微钙化是指由草酸钙（calcium oxalate，CO；CaC2O4·2H2O）组成的异位矿化，通常晶体呈琥珀色，半透光，形似金字塔，表面较为平整；Ⅱ型微钙化是指由磷酸钙组成的异位矿化，主要为羟基磷灰石［hydroxyapatite，HAp；Ca10（PO4）6（OH）2］晶体，通常呈灰白色，不透明，卵形或梭形，表面不规则［9］。此外，最新的研究证实，乳腺微钙化还存在第3 种矿物形式，即镁取代型HAp（MgHAp）［10］。

乳腺微钙化的类型可用于区分乳腺良恶性病损。O'Grady 等［4］发现，在55 名患者的活检样本中，CO 样本的检查结果均为良性；而活检样本中若存在HAp，结果均证实为恶性。同时，Frappart等［11］证实，Ⅱ型微钙化存在于所有乳腺癌病变中，包括浸润性癌、原位癌及导管癌；而Ⅰ型微钙化仅存在于良性肿瘤内。此外，第3 种矿物形式即MgHAp，亦仅存在于恶性肿瘤中［4］。

因此，乳腺病理性微钙化与乳腺良恶性肿瘤关系密切，探索微钙化的形成原因可有助于理解乳腺良恶性病损的发生及发展。

2 乳腺微钙化的形成机制

以往的观点认为，乳腺癌易发生病理性钙化的原因在于肿瘤细胞易发生退行性变。在高缺血缺氧环境下，大量肿瘤细胞坏死凋亡，矿物发生堆积，因此形成微钙化［6］。而最近的研究证实，乳腺癌的病理性矿化实则是肿瘤细胞积极介导的过程［12］。Cox等［12］首次提出，HAp 晶体首先在乳腺癌细胞内形成，随后被释放至细胞外基质（extracellular matrix，ECM）中，晶体沉积并形成微钙化。同时，最新研究表明，乳腺癌细胞会产生微钙化的原因在于正常的乳腺细胞转变为乳腺成骨样细胞（breast osteoblastlike cells，BOLCs）［10］。Scimeca 等［13］发现，BOLCs 胞质中可出现HAp 晶体，继而BOLCs 可通过细胞内囊泡的形式将矿物转运至ECM。而在生理性矿化过程中，囊泡在介导矿物转运及胶原矿化中同样起到了重要的作用［14］。因此，上述研究均表明，乳腺癌的病理性矿化与生理性矿化过程中矿物在硬组织中的沉积极其相似。同时，病理性微钙化的形成过程也是HAp沉积过程，因此，肿瘤细胞可调控HAp矿物原料——无机钙及磷酸盐的转运及积累，进而发生微钙化［12］。

钙离子转运相关蛋白annexins 家族与乳腺癌细胞内钙离子的转运相关。有研究表明，在乳腺肿瘤细胞内，annexin Ⅵ可作为肿瘤促进因子，而annexinⅠ与annexin Ⅱ可促进肿瘤细胞的侵袭［15］。同时，若乳腺细胞annexin Ⅵ缺失，则该类细胞的钙离子转运功能出现障碍，不能发生HAp 沉积［16］。此外，Zhang等［17］分析了与钙稳态调节密切相关的雷诺丁受体3（ryanodine receptor 3，RYR3）基因中miR-367 的结合位点，并证实A→G 的SNP 结合位点可促进乳腺细胞的钙化。

Cox 等［18］发现，微钙化的形成与碱性磷酸酶（al⁃kaline phosphatase，ALP）活性相关。ALP 可将焦磷酸盐（pyrophosphate，PPi）水解成无机磷酸盐（phos⁃phate，Pi），Pi 水平升高可促进微钙化的形成［19］。同时，有研究表明，肿瘤细胞的增殖活动较强，需要消耗大量的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），而ATP 水解后可产生大量的Pi，因此造成肿瘤微环境Pi浓度升高，促使HAp形成［20］。

肿瘤微环境在乳腺癌的发生发展中起到重要作用。细胞可通过与ECM 的相互作用影响肿瘤细胞的生长及侵袭，而胶原是构成乳腺ECM 最主要的成分，与乳腺微钙化形成同样相关。Cox 等［21］证实，乳腺癌细胞可在体外3D 胶原支架上生长增殖及发生微钙化。也有研究证实，在乳腺组织活检后植入的生物可降解胶原塞易引起植入位点乳腺微钙化［22］。

在生理性矿化中，钙磷矿物、胶原纤维及非胶原蛋白（non-collagenous proteins，NCPs）是骨组织发生矿化的基础。而乳腺癌病理性微钙化的发生除了与上述钙磷矿物及胶原相关，NCPs同样发挥了重要的作用［13］。骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是一种磷酸化的NCPs，在骨组织中含量较为丰富。Timotheadou等［23］证实，乳腺癌微钙化区常出现OPN 的高表达。此外，骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）相关mRNA在乳腺钙化区的表达水平升高；骨粘连蛋白（osteo⁃nectin，OSN）及骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）的高表达同样可促进乳腺癌的微钙化与矿物沉积［9，24］。也有研究证实，以上NCPs 可能与乳腺癌的骨转移关系密切［25］。

如前所述，乳腺病理性微钙化的形成与生理性骨组织矿化相似，包括矿物形成过程及钙磷转运机制。胶原作为生理性矿物沉积的模板，通常可发生胶原纤维内外矿化。然而，乳腺癌微钙化区是否存在胶原纤维的矿化及矿化胶原对乳腺癌细胞增殖及转移的具体影响机制，仍需更多研究证实。此外，NCPs 在乳腺癌微钙化区的过表达促进HAp 沉积的相关机制以及这种过表达是否会抑制HAp的成核继而提高骨转移的概率，则仍需进一步探究。

3 微钙化与乳腺癌发展的关系

在乳腺微钙化区，矿物若含有HAp 或MgHAp，通常认为是乳腺恶性肿瘤的信号［13］。究其原因可能在于，HAp 易与二价阳离子（如镁离子）发生结合，造成微环境中镁离子的耗竭继而影响正常的DNA损伤修复过程及细胞的增殖和凋亡过程。因此，HAp 或MgHAp 具有致癌特性［10，26］。其次，有研究利用合成的HAp 晶体模拟Ⅱ型钙化的肿瘤微环境，该研究证实乳腺癌细胞的有丝分裂增多［18］。Pathi等［27］发现，MDA-MB-231 及MCF-7 乳腺癌细胞在HAp 矿化支架中的增殖活动增强，迁移行为发生改变，溶骨因子IL-8 高表达。此外，HAp 还可引起乳腺细胞的炎性反应，从而使得环氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）表达增加［28］。而COX-2 是乳腺肿瘤发展的重要促进因子，与肿瘤的大小和恶性分级相关。另有研究证实，COX-2 抑制剂阿司匹林的长期使用可有效降低乳腺癌发病率，而COX-2 过表达可促进肿瘤侵袭［29］。

虽然Ⅰ型微钙化多与良性乳腺肿瘤相关，但最新的研究证实，Ⅰ型钙化会向Ⅱ型钙化发生转变，继而可表现为恶性肿瘤的特征［30］。Scimeca 等［13］发现，患者原乳腺病损处的良性CO 微钙化，在多年后会伴有HAp 形成，同时这些病例均由良性转为恶性程度高的低分化癌。他们通过共培养体系证实，乳腺癌细胞可由单核细胞介导成骨样改变，即形成BOLCs。BOLCs 形成的主要原因在于，乳腺细胞可在转化生长因子β（transforming growth factor β，TGFβ）作用下发生波形蛋白和连环蛋白易位，诱发上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程，使得乳腺细胞具备间充质细胞的特征［13］。随后，这些细胞在成骨相关蛋白如BMP2 的作用下，转变为BOLCs，继而发生矿物异位沉积［10］。

对微钙化与乳腺癌发生分子机制的深入探索有助于我们进一步理解两者的相关性。而目前，越来越多的研究证实，与微钙化形成相关的BOLCs 及EMT 过程在乳腺癌的侵袭或骨转移中也起到了重要作用［31］。

4 微钙化与乳腺癌骨转移的关系

在乳腺病变中，微钙化的形成是BOLCs 活动及EMT 过程发生的信号，同时也可能是乳腺癌发生骨转移的信号。Bonfiglio 等［32］通过5 年随访发现，微钙化如MgHAp 可通过BOLCs 活动造成骨转移。BOLCs 活动不仅能与成骨细胞产生亲和力，而且可表达能够调节骨稳态的多种分子如核因子κB 受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）、Runt 相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）、维生素D 受体（vita⁃min D receptor，VDR）、OPN等［13，33］。

有研究表明，BOLCs 相关生物标志物（如RANKL 和RUNX2）的表达与乳腺癌骨转移相关，如波形蛋白-RUNX2-RANKL呈阳性的患者更容易在诊断后的5 年内发生骨转移［34］。由于乳腺细胞转变为BOLCs 经历了EMT 过程，而EMT 现象使得肿瘤细胞获得了在体循环中迁移的能力，成为循环肿瘤细胞（circulating tumour cells，CTCs），这也是肿瘤细胞骨转移的重要因素之一［35］。

有研究证实，微钙化区常出现OPN 表达升高。OPN具有双向促进作用，其既可以促进HAp形成，又可以促进乳腺癌细胞发生远处骨转移［30］。此外，Ⅱ型微钙化可上调基质金属蛋白酶（matrix metallopro⁃teinases，MMPs）的表达及活性，MMPs 是乳腺癌发展的多功能促进因子，可促进EMT 过程，增加RANKL表达，造成溶骨性骨转移［36-37］。同时，乳腺癌微钙化区可出现TGFβ 表达升高，而TGFβ 在乳腺癌骨转移和侵袭中具有重要作用［13］。有研究表明，乳腺癌骨转移瘤中TGFβ 信号较为活跃，而使用TGFβ 抑制剂或基因敲减技术则可以有效阻止肿瘤细胞的生长及远处转移［38］。

此外，在肿瘤微环境中含量丰富的胶原不仅可促进微钙化的形成，同时也与乳腺癌骨转移相关。有文献表明，胶原作为保护性屏障可以抑制肿瘤细胞的侵袭，然而最近的研究证实保护性屏障较弱的胶原纤维反会促进肿瘤的转移［39］。由于该种胶原的保护力较弱，从而造成大量恶性肿瘤细胞的堆积，继而肿瘤细胞易于黏附于长条形的胶原纤维表面，胶原从而成为了肿瘤细胞发生迁移的“快速通道”并加快骨转移过程［40］。

因此，微钙化可能是乳腺癌骨转移的信号（相关机制总结的示意图见图1）。

5 微钙化诊断成像——早期识别高转移潜力的乳腺癌

早期诊断及早期识别出具有高转移潜力的乳腺癌对其治疗及预后均具有重要意义。对乳腺微钙化的物理化学特征进行分析，可有助于区分不同类型的乳腺病损。目前，通过临床成像技术如乳腺X 射线技术，并不能可靠地区分Ⅰ型和Ⅱ型钙化，因而不能诊断出具有高转移潜力的乳腺癌（如微钙化中若含有HAp 或MgHAp 可造成骨转移）［4］。因此，乳腺活检技术常运用于临床以区分乳腺良恶性病损。但是，活检技术具有一定创伤性，无论是穿刺活检或是手术切除活检，患者可能出现疼痛、血肿、局部感染等并发症，甚至可能出现假阴性诊断结果［13］。因此，如何通过无创可视化检测技术鉴别病理性钙化分型，并将该技术转化为临床应用是当前研究的新兴领域。

Figure 1. Breast microcalcification promotes breast cancer metastasis to bone. TGFβ：transforming growth factor β；EMT：epithelialmesenchymal transition；BMP：bone morphogenetic protein；HAp：hydroxyapatite；MgHAp：magnesium-substituted hy⁃droxyapatite.图1 乳腺微钙化促进乳腺癌骨转移机制图

有诸多研究表明，拉曼光谱作为一种散射光谱，可以区分Ⅰ型和Ⅱ型钙化。虽然散射可造成光损失，限制了拉曼光谱运用的深度，但最新的技术表明，拉曼光谱可在40 毫米的深度进行组织内矿物分析［41］，因此可作为一种非侵入性的临床成像技术来识别恶性肿瘤的微钙化。最近的一项研究甚至利用拉曼光谱分析患者的血液样本中HAp 含量的变化，以证实乳腺良恶性肿瘤［42］。另外，正电子发射体层成像技术（positron emission tomography，PET）是一种放射性同位素成像技术，也可用于检测乳腺的异位钙化［13］。Ahrens 等［43］在大鼠乳腺癌模型中利用荧光素标记的阿仑膦酸盐（64Cu-DOTA-阿伦膦酸钠）结合PET 技术来监测和标记乳腺原位微钙化。由于64Cu-DOTA-阿伦膦酸钠对HAp 具有特异性结合的能力，因此是一种可用于鉴别微钙化乳腺病变的新型PET示踪剂，且具有测灵敏度高、特异性强等优点。

用于鉴别乳腺病理性钙化分型的可视化检测技术有利于对具有高转移潜力的乳腺癌进行早期诊断，该技术如今得到快速发展，如放射性示踪剂的运用、新型X 射线成像技术等。这些技术运用于乳腺癌微钙化检测不仅可改善患者的就医体验及依从性，也可为医生提供诊断、治疗的新选择。

对于具有高转移潜力的乳腺癌的治疗策略也可集中于分析BOLCs活动相关的分子。抗BOLCs生物标志物也可用于诊断和治疗乳腺癌［13］。目前，抗RANKL 通路分子已经运用于对抗骨质疏松症，后续也可成为乳腺癌的治疗策略，如新型双膦酸盐可以用于抑制肿瘤转移龛在骨组织中的定植和增殖等［44］。同时，有研究通过联合用药途径——TGFβ 抑制剂联合抑制肿瘤低氧环境，得到了较好的治疗效果［45］。因此，采用最佳给药方式，如联合用药相比于单独用药，也可以有效抑制肿瘤生长及骨转移。

6 结语

乳腺微钙化本质上是一种病理性的矿物沉积，也是一种异位钙化。微钙化中CO、HAp 及MgHAp的形成实则是肿瘤细胞积极调控的过程，与生理性硬组织矿化过程极相似。同时，微钙化又可促进乳腺癌及乳腺癌骨转移的发生。然而，微钙化区是否会存在如同正常骨组织中胶原纤维的内外矿化、NCPs 在介导矿物沉积及对乳腺癌骨转移的作用机制、微钙化促进乳腺癌发生及转移的具体分子机制依旧不明确。因此，仍需更多研究以完善关键调控因子作用、开发新型成像技术、建立临床相关微钙化-乳腺癌骨转移模型，以更好地评估骨转移的风险进而对易发生骨转移的乳腺癌患者进行分类，从而为个性化、靶向性的精准治疗方式提供指导，最终提高骨转移患者的生存率及生存质量。