银杏内酯B抑制非酒精性脂肪性肝病大鼠肝脏极低密度脂蛋白输出*

武俊紫， 赵 茜， 罗德霞， 范晓明， 马 琼， 石安华，2△

（1云南中医药大学基础医学院，云南昆明650504；2云南省高校中医证候微观辨证重点实验室，云南昆明650500；3桂林医学院广西系统医学重点实验室，广西桂林541100）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）危害极大，需在早期积极干预，干预不及时除可给自身带来损害外，还可引起动脉硬化、冠心病等多种疾病的发生［1］。而在引起相关血管病变的因素中，极低密度脂蛋白（very-low-density lipoprotein，VLDL）是不可忽视的一个因子［2］。VLDL由甘油三酯、胆固醇、磷脂以及一些蛋白构成，主要由肝脏合成，正常情况下，其可以负责转运甘油三酯和胆固醇等以供机体需求［3］，但如果肝细胞受到损伤，肝脏过量分泌VLDL 则可引起动脉硬化的发生。此外VLDL会在肝细胞中过量沉积，这种过量沉积可引起脂质发生一系列代谢紊乱，这也是脂肪肝病发病的原因之一［4］。因此，如何控制肝脏VLDL 的生成对NAFLD 的治疗具有积极的意义，为此本研究采用银杏内酯B（ginkgolide B，GB）治疗脂肪肝病大鼠，以为NAFLD的治疗提供一定的参考。

材料和方法

1 实验材料

1.1 动物 6 周龄清洁级雄性SD 大鼠72 只，体重160～180 g，购买于昆明医科大学动物实验中心，合格证号为SCXK（滇）K2015-0002。由云南中医药大学动物实验部专业人员统一喂养，实验室温度、湿度由中央空调统一控制，温度22～27℃，湿度40%～60%，日常采光由灯光控制，光照/黑暗为12 h/12 h 交替，购买后适应性喂养10 d。

1.2 药品与试剂 辛伐他汀（simvastatin，SIM）购自北京福元医药股份有限公司；银杏内酯B（成都德思特生物技术有限公司）；丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；VLDL 和低密度脂蛋白（low-density lipopro⁃tein，LDL）试剂盒（上海恒远生物技术发展有限公司）；微粒体甘油三酯转运蛋白（microsomal triglycer⁃ide transfer protein，MTP）、载脂蛋白B-100（apolipo⁃protein B-100，ApoB-100）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（Santa Cruz）。

1.3 仪器 低温高速离心机（TGL-16.5M 型，上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；紫外-可见分光光度计（UV-8000 型，上海精密仪器仪表有限公司）；酶标仪（YT-MB96型，山东云唐智能科技有限公司）；蛋白电泳仪（Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell 型，Bio-Rad）。

2 实验方法

2.1 动物分组、造模及给药 72只大鼠按照随机数字表法分为6组，分别为正常对照（control，CON）组、NAFLD 模型（model，MOD）组、阳性药物SIM 组及银杏内酯B 低、中和高剂量（low-，medium- and highdose ginkgolide B，GB-L、GB-M 和GB-H）组，每组12只。造模时，正常对照组给予普通饲料+普通自来水喂养12 周，其余5 组给予高脂高糖饲料+5%红糖水喂养12 周，12 周后每组各取2 只大鼠检测造模是否成功，NAFLD 造模成功的标准为［5］：肝脏病理学有明显大量脂肪空泡，同时肝功能和血脂呈明显异常。造模成功后给予相应治疗，CON 组和MOD 组给予1 mL·kg-1·d-1生理 盐水 灌胃 治疗，SIM 组 给予2 mg·kg-1·d-1SIM 治疗，银杏内酯B 3 个剂量组分别给予0.5、1.0和2.0 mg·kg-1·d-1银杏内酯B 治疗。治疗时间为4周。

2.2 组织收集方法 4 周后禁食不禁水12 h，分批次处死大鼠，大鼠处死时采用戊巴比妥钠麻醉，麻醉后将其固定于解剖板，采用腹主动脉取血法收集血液，收集后置入含有抗凝素的血液采集管中备用，后取出肝脏，肝脏取出后切取肝左叶置入组织固定液中保存用于病理学检测，其余组织切成1 cm×1 cm×1 cm左右的小块，置入超低温冰箱中保存备用。

2.3 相关生化指标检测方法 所有生化指标包括AST、ALT、肝脏和血液VLDL和LDL的检测均根据试剂盒提供的说明书进行，其中AST 和ALT 的检测仪器为分光光度计，肝脏和血液VLDL和LDL的检测仪器为酶标仪。

2.4 肝脏组织病理学检测 肝脏病理学检测采用HE 染色法进行，石蜡包埋、切片、脱蜡、梯度乙醇脱水、苏木精-伊红染色，透明后中性树脂封片即可，完成后采用光学显微镜观察并采集图像（每张切片选取4个不同的视野）。

2.5 免疫荧光法 从超低温冰箱中取出一块肝脏组织，用丙醇（-20℃）固定15 min 后，采用磷酸盐缓冲液洗涤3次，用0.5%的Triton X-100孵育10 min后洗涤3 次，细胞核染色后洗涤3 次，加入MTP 或ApoB-100 抗体，4℃冰箱中孵育过夜后洗涤3 次，加入Ⅱ抗于室温中避光孵育30 min，洗涤3 次后封片，荧光显微镜观察并采集图像（每张切片选取4 个不同的视野）。

2.6 蛋白检测方法 蛋白的检测采用Western blot法进行，从超低温冰箱中取出肝脏组织，提取总蛋白后定量并调平，然后每组各取50 μg行SDS-PAGE，后依次经转模、脱脂牛奶封闭、Ⅰ抗（MTP 稀释比例为1∶1 000，ApoB-100 稀释比例为1∶4 000，GAPDH 稀释比例为1∶3 000）过夜孵育，Ⅱ抗（1∶2 000）孵育30 min 后显色收集图像即可。结果以所测蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值作为所测蛋白的相对表达量。

3 统计学处理

计量资料采用均数±标准差（mean±SD）表示。统计分析采用SPSS 23.0 软件。均数间组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD 法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组肝功能的比较

与CON 组相比，MOD 组血清AST 和ALT 显著升高（P＜0.05）；与MOD 组相比，SIM 组和银杏内酯B 3个 剂 量 组AST 和ALT 均 显 著 降 低（P＜0.05），见表1。

表1 各组肝功能指标的比较Table 1. Comparison of liver function indexes in each group（Mean±SD. n=10）

2 各组肝脂和血脂的比较

与CON 组相比，MOD 组血清VLDL 和LDL 及肝脏VLDL 和LDL 均显著升高（P＜0.05）；与MOD 组相比，辛伐他汀和银杏内酯B 3个剂量组上述指标均显著降低（P＜0.05），见表2。

表2 各组血脂和肝脂指标的比较Table 2. Comparison the levels of blood lipid and liver lipid in each group（Mean±SD. n=10）

3 各组肝脏病理学变化

肝脏组织HE 染色结果可见，CON 组肝脏组织结构清晰完整，肝细胞排列整齐且大小基本一致，细胞核则基本均分布于细胞中央；MOD 组则弥漫有大量大小不等的脂肪颗粒，细胞核受到挤压基本均紧贴于细胞膜；与MOD 组相比，GB-H 组肝组织结构清晰完整，肝细胞核居中，大小一致，部分区域出现少量脂肪颗粒；GB-M 组肝细胞大小基本一致，出现少量的脂肪颗粒；GB-L 组肝小叶结构基本完整，出现较少脂肪颗粒；SIM 组肝细胞大小不等，可见部分区域大小不等的空泡脂肪变性现象，见图1。

Figure 1. The images of the liver tissue with HE staining. Each arrow indicates the fatty degeneration of each group.图1 各组大鼠肝组织HE染色图

4 MTP和ApoB-100蛋白免疫荧光染色结果

MTP 免疫荧光染色结果显示，CON 组只有很弱的绿色荧光，且分布不均匀，而MOD 组则有很强的绿色荧光，且分布基本均匀，主要位于细胞质中；与MOD 组相比，SIM 组绿色荧光分布集中，GB-L 组绿色荧光部分聚集分布，GB-M 组绿色荧光散在分布，GB-H组绿色荧光分布与CON组无明显差异，且各治疗组荧光强度明显较MOD组减弱，见图2。

Figure 2. Immunofluorescence of MTP in rat liver.Each arrow indicates the green fluorescence of each group.图2 大鼠肝脏组织中MTP的免疫荧光图

ApoB-100 免疫荧光染色结果显示，CON 组部分区域存在散在的绿色荧光；而MOD 组则有很强的绿色荧光，且分布基本均匀，主要位于细胞质中；与MOD组相比，各治疗组荧光强度明显减弱，且呈散在分布，见图3。

Figure 3. Immunofluorescence of ApoB-100 in rat liver. Each arrow indicates the green fluorescence of each group.图3 大鼠肝脏组织中ApoB-100的免疫荧光图

5 MTP和ApoB-100蛋白的表达

与CON 组相比，MOD 组MTP 和ApoB-100 表达均显著升高（P＜0.05）；与MOD 组相比，辛伐他汀和银杏内酯B治疗后均可以显著降低MTP和ApoB-100表达，此外银杏内酯B 要低于辛伐他汀组（P＜0.05），见图4。

Figure 4. The expression of MTP and ApoB-100 proteins in rat liver. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs MOD group.图4 大鼠肝脏中MTP和ApoB-100蛋白的表达

讨 论

银杏内酯B 在中风、冠心病和动脉粥样硬化等多种疾病方面有大量文献报道。此外，近年来观察到银杏内酯B 对改善血脂也有一定的疗效，如郭茂娟等［6］研究表明，银杏内酯B可降低高胆固醇诱导的PC12 细胞胆固醇含量，龙思琴［7］等研究检测到银杏内酯B 具有一定的改善脂肪肝病小鼠肝细胞脂肪变性和脂质异常蓄积的作用，基于其可以降脂的理论，本研究采用银杏内酯B治疗NAFLD。造模方法采用实验室经典造模法，在银杏内酯B 剂量的选择上，我们根据临床治疗冠心病的剂量（5 mg/kg）［8］进行了预实验，但过程中观察到5 mg/kg 银杏内酯B 灌胃NAFLD 大鼠出血率较高，分析原因可能与银杏内酯B 本身抗凝血作用有关，由于1 mg/kg 银杏内酯B 可以达到显著的降脂作用，故本研究以较低的1 mg/kg为中剂量。实验结果表明，与CON 组相比，MOD 组大鼠肝组织、血清AST 和ALT 显著增高，且HE 染色可见大量脂肪颗粒；经银杏内酯B 治疗4 周后，大鼠肝组织、血清AST 和ALT 显著降低，并且改善了肝脏病理学，提示银杏内酯有改善NAFLD 血脂、肝功能的作用，进一步验证了银杏内酯B的降脂作用。

肝脏甘油三酯的异常堆积是NAFLD 的发病基础。VLDL 是脂肪颗粒在肝脏中聚集的主要因子，主要由肝脏合成并分泌，参与VLDL合成的两个因子主要为ApoB-100 和甘油三酯，ApoB-100 主要在内质网中发生折叠和转运，最终为高尔基体内VLDL的组装做准备［9-10］。而甘油三脂则被认为主要借助MTP 与ApoB-100 结合形成VLDL，VLDL 在进入血液后，大部分变成LDL，从而导致甘油三酯蓄积，促进NAFLD的发生发展［11］。Chan等［12］实验研究显示肝脂肪变性会增加VLDL-ApoB-100的分泌。同时，Wu等［13］实验研究表明广香醇对NAFLD 的治疗作用，可能是通过增加ApoB-100 分泌和微粒体MTP 活性来恢复VLDL的合成和输出的。本研究显示，与MOD 组相比，银杏内酯B治疗后，大鼠血液和肝脏中VLDL 和LDL均明显降低，提示银杏内酯B对VLDL 和LDL均有明显的调节作用。此外，与MOD 组相比，大鼠肝脏中MTP 和ApoB-100 表达明显降低，提示银杏内酯B 降低血脂的作用可能是通过调节MTP 和ApoB-100 表达实现的。

综上所述，银杏内酯B能通过调节MTP和ApoB-100 表达，进而抑制NAFLD 大鼠肝脏VLDL 的输出，延缓NAFLD 进程。但本研究尚有不足之处，在今后研究中需从体外进一步探讨银杏内酯B 与VLDL 的具体关系及作用机制。