源于奶牛蹄部感染的牛源污蝇解壳杆菌的分离鉴定与药敏试验

王志浩，郭 龙，刘康军，李 俊，李建基，崔璐莹，孟 霞，朱国强，钱 晨，王 亨

(扬州大学 兽医学院/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009)

污蝇解壳杆菌(Wohlfahrtiimonaschitiniclastica)是一种需氧、革兰阴性短杆菌。于2008年首次在匈牙利布达佩斯的污蝇第三期幼虫中分离和鉴定[1]。2012年，中国首次在上海浦东国际机机场收集的大头金蝇(Chrysomyiamegacephala)体内分离出污蝇解壳杆菌[2]。2016年，山东某奶牛场患有蹄冠炎的奶牛病灶处分离到1株污蝇解壳杆菌[3]。2017年，在吉林省某肉牛场1头育肥肉牛眼睑化脓病灶处分离得到了1株污蝇解壳杆菌[4]。2019年，江苏省某奶牛场多只患有腐蹄病奶牛的脓性分泌物中分离得到同一株菌，命名为JS2019224,通过鉴定，确定为污蝇解壳杆菌，并对分离到的细菌进行药物敏感性试验，以期为该种细菌引发的奶牛蹄病的预防和治疗起一定的指导作用，并对人畜共患病提出预警，提高奶牛场的饲养管理水平。

1 材料与方法

1.1 病料来源江苏省某奶牛场出现多例蹄部化脓感染性疾病(图1)，病程2～3周，后肢出现跛行，蹄部红肿，蹄夹沟出现溃烂、流脓，部分蹄壳脱落。使用双氧水清洗后用10% 碘伏消毒，病灶处撒高锰酸钾涂抹松馏油后绷带缠绕进行包扎固定，但治疗效果不明显。

图1 蹄部感染照片

1.2 主要试剂及仪器胰蛋白胨和酵母提取物购自OXOID公司；Baird-Parker琼脂购自青岛海博生物技术有限公司；Mueller-Hinton Agar琼脂购自青岛科技园海博生物技术有限公司；质控标准品、甲酸和基质溶液购自德国布鲁克公司；MALDI Biotyper微生物鉴定系统购自德国布鲁克公司；抗菌药物药敏纸片(12种)购自杭州微生物生物试剂有限公司；紫外可见分光光度计SP-2000UV型购自上海光谱仪器有限公司。

1.3 细菌分离及纯化用生理盐水对感染灶进行大量冲洗，无菌采集病灶组织。在超净台内无菌操作，将采集的样品接种于含有5% 绵羊鲜血的琼脂培养基，于37℃ 恒温培养箱培养18～24 h。挑取单菌落，转培进行纯培养，后涂片，革兰染色镜检。

1.4 污蝇解壳杆菌的鉴定参考文献[5]中的方法，挑取单个菌落，涂抹至MALDI靶板上，同时在靶板上加1 μL质控标准品(BTS)，用于质量校准和仪器参数优化，自然干燥。在单菌落涂层上加入1 μL 70% 甲酸水溶液，自然干燥。然后，在单菌落涂层上，加入1 μL基质溶液，自然干燥。放入质谱仪获得质谱图，通过特异性的指纹图谱，与Biotyper数据库进行比对，完成微生物的鉴定。

1.5 药物敏感性试验K-B 法药敏试验检测污蝇解壳杆菌分离株的药物敏感性。将保存的冻菌液三区划线法接种于5% 鲜血平板培养基上，置于37℃ 培养箱中 18～24 h，挑取单个菌落加入LB液体培养基进行培养。用浊度仪配成0.5麦氏单位菌液，在M-H琼脂表面均匀涂布，接种3次，每次平板旋转60 度，最后沿平板内缘涂抹一周，置室温干燥5 min；将药敏片贴于琼脂表面，室温放置15 min后，倒置于37℃恒温培养箱，培养16～18 h，测量药敏纸片的抑菌圈直径大小。药敏试验结果判定按照CLSI 药敏标准执行，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。

2 结果

2.1 形态及培养特性观察所分离的污蝇解壳杆菌命名为JS2019224，接种于5% 绵羊鲜血琼脂培养基37℃ 培养24 h呈β溶血(图2)；呈深灰色，边缘整齐，圆形隆起的菌落(图3)。革兰染色观察，为革兰阴性菌，两端钝圆，短杆棒状(图4)。

2.2 MALDI Biotyper微生物鉴定系统检查结果所分离菌株JS2019224的特异性指纹图谱与Biotyper数据库进行比对，鉴定为污蝇解壳杆菌，指纹图谱见图5。

图2 溶菌活性呈β溶血

图3 细菌培养照片

图4 革兰染色镜检结果

2.3 污蝇解壳杆菌药敏试验见表1。根据 K-B纸片扩散法的原理及美国临床和实验室标准协会的规定，使用直尺对各抗生素产生抑菌环直径大小进行测量，判断其耐药或敏感。结果显示，分离到的污蝇解壳杆菌对多黏菌素、丁胺卡那、克林霉素、庆大霉素、环丙沙星5种抗生素敏感。对阿莫西林钠-克拉维酸钾、多西环素、四环素、链霉素、青霉素、复方新诺明和头孢氨苄7种抗生素耐药。

图5 污蝇解壳杆菌质谱峰图

3 讨论

污蝇解壳杆菌首次报道于2008年，由TOTH等[1]在污蝇第三期幼虫体内分离得到并鉴定，其为需氧菌，在 pH 5.0～10.5生长良好，最佳生长温度为28～37℃。据报道，污蝇解壳杆菌可引起人的败血症[6]，败血症病例主要来自欧洲和南美洲，患者包括2009年法国东南部一名60岁的无家可归女子[7]，2011年美国南部一名70岁无家可归男子[8]和英国一名82岁女子[9]。动物感染后发生败血症的病例报道于2014年美国密歇根州1只鹿[10]。污蝇解壳杆菌除造成败血症外，还可造成其他疾病：2012年，据报道，在尼日尔一名患有口面坏疽儿童的皮肤和软组织中分离到污蝇解壳杆菌[11]；2015年，印度报道在一例骨髓炎病例中分离得到污蝇解壳杆菌[12]；2015年，美国报道在纽约一名26岁男性的腿部感染伤口处分离到污蝇解壳杆菌[13]；2019年，美国报道了两例，一名右脚患有慢性足坏疽的63岁男子和一名左下肢患有蝇蛆病的87岁女子[14]；2019年12月西班牙首次报道在一例左臂发生溃疡的病灶处分离得到污蝇解壳杆菌[15]。所有报道病例中，最北部地区是爱沙尼亚，于2015年在一名患有慢性足坏疽的64岁男子的病灶处分离得到污蝇解壳杆菌[16]。

表1 分离株的药敏试验结果

我国于2012年在上海浦东机场周围收集到的污蝇体内分离得到污蝇解壳杆菌，通过使用16S rRNA对其进行鉴定，确定为污蝇解壳杆菌。此后，2016年，于山东某患蹄冠炎的奶牛病灶处分离得到污蝇解壳杆菌；2017年，在吉林患眼睑炎的肉牛病灶处分离得到污蝇解壳杆菌。本次报道为2019年3月从江苏省某患蹄病的奶牛病灶处分离得到1株污蝇解壳杆菌。这表明该人畜共患性病原菌在中国多个地方呈零星散发。由于这种病原菌的主要传播媒介为蚊蝇等昆虫，所以做好圈舍的驱虫灭蝇及日常的消毒工作是非常重要的。

污蝇解壳杆菌作为一种人畜共患病病原菌，其耐药性也需要高度重视。2016年报道的源于山东蹄叶炎的分离株，其药物敏感性检测结果显示对所有测定的抗生素均敏感。2017年吉林分离得到的污蝇解壳杆菌对红霉素、青霉素和头孢拉定3种抗生素耐药。而本次分离得到的污蝇解壳杆菌对阿莫西林钠-克拉维酸钾、多西环素、四环素、链霉素、青霉素、复方新诺明、头孢氨苄等7种抗生素耐药。这表明该细菌的耐药性在不同区域存在差异，同时其耐药问题需要高度重视，应加强临床治疗抗生素的规范使用，减少耐药菌株的产生。科学准确快速地对病原菌进行分离鉴定以及药物敏感性的检测，对细菌感染类疾病的治疗可以起到良好的效果。该研究在进行细菌分离鉴定时使用了MALDI Biotyper系统，与普遍应用的生化反应鉴定以及16S rRNA方法相比，具有更加准确、快速、方便的特点，对临床中发生的细菌感染性疾病可以快速鉴定病原菌的种类。

目前报道的人感染污蝇解壳杆菌大多发生在环境恶劣的地方，蝇蛆的大量繁殖会促进细菌的传播。而在畜禽养殖环境中，不同程度存在蝇蛆的问题，故鉴于此，需要加强饲养管理，注重环境卫生，提高动物机体自身免疫机能，合理规范使用抗生素药物，减少疾病的发生，以获得更高的经济收益。