免疫层析技术及应用的研究进展

李雨芮,刘晓雅,张文劲,陈颖钰，2,郭爱珍，2，胡长敏，2*

(1.华中农业大学 动物医学院，湖北 武汉 430070；2.华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉 430070)

胶体金(colloidal gold)作为一种用于免疫学研究的标记物，最早由FAULK等[1]于1971年在试验中标记兔抗沙门菌血清制备得到金标抗体，成功地检测出沙门菌表面抗原而提出。1974年ROMANO标记马抗人IgG的成功使得间接免疫金染色法首次被用于实践，免疫胶体金技术开始高速发展。自20世纪70年代始，陆续出现了多种以胶体金技术为基础、在光镜及电镜水平上与银显影和彩色免疫金银染色相结合的技术，使得胶体金免疫诊断有了许多新的应用和发展[2-4]。当前，在兽医临床快速诊断中的应用较多的主要是胶体金免疫层析法(colloidal gold enhanced immunochromatography assay,GICA)以及快速斑点免疫金渗滤法(dot-immunogold filtration assay,DIGFA)，两者的区别主要在于GICA的待测样品由于毛细作用在微孔膜上采取平行于膜的方向移动，又称作侧向层析免疫层析法(lateral flow immunoassay,LFIA)；而DIGFA的待测样品则是基于渗滤作用在微孔膜上垂直于膜运动，又称穿流式(flow through)固相膜免疫层析法[5]。免疫胶体金技术由于成本较低、样品处理简单、操作方便易行、反应迅速的同时还兼具灵敏方便等优点，在生产实际及生活中应用广泛。

随着各类新技术的发展，免疫层析技术也在不断更新换代，出现了可以一次检测多个对象及多个检测线的试纸条；标记物的改良使得结合垫上的标记物多种多样，纳米微粒、荧光微球、量子点等标记物逐渐被开发利用；同时，样品垫上添加的检测物也不局限于经典的血清等体液成分，核酸扩增等反应的产物也开始作为试纸条的检测对象，免疫层析技术迎来了新的发展篇章。

1 胶体金免疫层析技术原理

胶体金是各种还原剂作用于氯金酸(HAuCl4)后生成的一定大小的金颗粒，其在溶剂中表现出稳定的胶体状态。碱性环境中胶体金颗粒(图1)与表面带正电的抗原/抗体结合，所形成的胶体金-蛋白免疫复合物既具有稳定性，还保持了生物活性，可以作为一类示踪标记物在免疫层析中参与反应，并显现肉眼可辨的颜色。研究表明，粒径在15 nm以上的胶体金在人肉眼观察结果时较为理想[6]。

图1 胶体金胶粒示意图(Au+.金离子；e-.负电荷)

向胶体金免疫试纸条上滴加液性样品后，毛细作用使金标物和样品中的特异组分一起向试纸条的另一端，即吸水垫方向运动。运动过程中样品和金标物依次与NC膜上的检测线(test line，TL，T线)、质控线(control line，CL，C线)反应，表现出显色或消线的结果供检测人员判定(图2)。整个过程耗时几分钟到几十分钟不等，结果简明易判，这是胶体金免疫层析法在临床样品初筛检测上的一大优势。

图2 胶体金免疫试纸条结构侧面观

2 免疫层析技术研究进展

2.1 胶体金为标记物的免疫层析胶体金免疫层析已经发展成为了一种灵敏快速、可行性高且相对其他检测手段操作更加简单方便的技术，极其适用于定性检测。在人类医学和动物医学的临床检验、疾病检测、食品安全检测以及其他相关领域中，胶体金技术都有相当广泛的应用。较为常见的人用产品如人绒毛膜促性腺激素检测试纸条、人免疫缺陷病毒抗体检测试纸条、梅毒血清抗体检测试纸条、疟原虫感染检测试纸条等，不仅节约了大量的检查化验时间，还具有相当的可靠性[7-9]，适合患者的自检以及临床疾病的初筛。

在动物性食品安全检测方面，GUO等[10]开发了基于金标单抗快速检测食品中螺旋霉素的试纸条，肉眼即可观察定性结果，视觉检测极限为1.0 μg/L，cut-off值为10 μg/L，可以作为现场筛查牛奶和牛肉样品中螺旋霉素残留的有效工具；有研究证明，在检测克伦特罗残留的多种方法中，对包括胶体金快速检测卡、ELISA、液相色谱串联质谱法等的检测效果比较发现，胶体金快速检测卡虽然假阳性率较高，但是基本不会漏过阳性样品，是临场检验的有效初筛手段[11-13]。除了经典的T、C双线模式的试纸条之外，可同时检测多个对象的试纸条也发展迅速、广为流行。吴玉晗等[14]开发的可以同时检测牛奶中的四环素和青霉素的双重胶体金试纸条检测限为2 μg/L，方法简单可靠，且特异性好；同样，在牛奶中可能存在的过敏原检测方面，胶体金免疫层析法与常规蛋白质检测方法灵敏性几乎相当[15]。

在动物疾病的临床检测及防控上，近年来胶体金试纸条也有大量的创新和应用，为生产管理提供了便利。例如在牛结核病防制领域，张书环[16]曾在2007年利用牛分枝杆菌MPB83和MPB70蛋白成功建立了一种牛结核病胶体金免疫层析方法，填补了当时检测牛结核病的胶体金试纸条市场的空白；经验证，该方法具有高特异性，而且敏感性显著高于国外进口试纸条。叶俊等[17]通过制备MPB70+83融合蛋白和单抗，初步建立了一种特异性好、灵敏度高的胶体金免疫层析方法，为筛查感染早期的牛只提供了快速有效的技术手段。在实验室诊断方面，STEWART等[18]开发并在多个实验室水平评估了一个检测牛分枝杆菌的新型胶体金免疫层析方法，并证明了此方法具有快速检测培养基培养后区分到种的潜力。在其他动物疾病的检测方面，李成洪等[19]研制的检测猪瘟抗体的胶体金检测卡通过标记和包被猪瘟重组E2蛋白，结合应用胶体金定量读数仪，对样本中的猪瘟抗体能做到较精确的定量检测；赵肖等[20]建立的针对猪肺炎支原体血清和鼻拭子中抗体的胶体金试纸条经过试验评价验证，与商品化ELISA检测方法符合率可高达96.1%。

2.2 以新材料为标记物的免疫层析虽然目前市场上的主流侧向层析产品还是基于胶体金技术的试纸条，但是随着材料技术的不断发展，越来越多的以各类纳米荧光材料为主的新标记材料被开发应用于侧向免疫层析，效果卓著。此类材料具有特殊的结构和电磁学性能，代替胶体金作为显色剂应用于试纸条后，人们可以根据激发的荧光波长和强度对微量待测物进行更高精度的定量评价，是一类新兴的生物传感器[21-23]。基于新材料的侧向层析方法相比于传统胶体金方法更能满足高敏感性、高通量和可量化的现代试纸条体外诊断要求，是技术层面的一大质的飞跃和突破。

2.2.1时间分辨与镧系元素荧光免疫层析 时间分辨荧光免疫荧光法(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)是一类通过标记镧系元素，也称稀土元素(rare earth elements,REE)，使之与抗原/抗体螯合并被激发出一定波长荧光，同时对荧光波长和发光时间两个参数进行检测的新型检测技术[24]。由于标记物体积小、标记物对被标记的大分子蛋白的空间结构影响极低、信噪比高及波峰尖锐等特点，非特异荧光信号对结果的干扰降低，TRFIA的灵敏度显著提升[25]。崔乃良等[26]利用TRFIA建立的检测水产品中氯霉素含量的试纸条，通过测量计算T/C值与国标仪器方法检测结果高度一致。镧系荧光免疫方法(LFICA)以TRFIA为基础，可以对超微量的待测物进行快速检测，目前已有文献报道在多种传染病检测上的应用。吴昊星等[27]开发了检测猪瘟的LFICA试纸条，与成品ELISA试剂盒比较的总符合率达97.7%，与荧光抗体中和试验(fluorescent antibody virus neutralization test,FVNT)的总符合率可达98.5%，其中阴性符合率为100%。此外在猪蓝耳病、禽流感、猪圆环病毒病等多种疾病的防制方面，LFICA试纸条的相继研发和评价结果也提示此类方法具备安全无放射性、兼具快捷与灵敏以及仪器便携易操作等优点，且有良好的应用前景[28-30]。

2.2.2荧光微球免疫层析 用于荧光微球免疫测定(fluorescent microsphere immunoassays,FMIA)的微球材料常见的有硅、磁、硒及高分子材料等，直径在纳米级到微米级间，通常采取在其表面标记荧光物质或在微球内置镧系元素的方法制备得到[31]。相比于最早的荧光素标记法，微球可以较好地保护荧光物质，增加荧光的稳定性；微球体积较小，却有较好的富集作用，可以降低方法的检测限。近年也已发展出了用于免疫层析的新型聚集诱导发射荧光微球(aggregation-induced emission fluorescent microsphere,AIEFM)。有报道称，相比于传统荧光微球，使用AIEFM可以将分析的灵敏度提高7～11倍[32]。康业等[33]开发的检测犬C-反应蛋白的免疫层析方法与进口试剂盒相关性好，适用于临床检测；黄震等[34]利用免疫磁珠富集牛奶中的沙门菌，有效规避了基质干扰，建立了高灵敏度的检测方法。此外，利用稀土元素制备的上转换发光材料的各类研究也开始起步，由于其具有反斯托克斯位移特性，洪霞等[35]研究发现在检测核酸时，使用上转换荧光标记是使用有机染料Cy5标记效果的4倍，灵敏度的显著提高提示更大的发展意义。

2.2.3量子点免疫层析 量子点是一类半导体材料，比表面积大，生物相容性和稳定性优良。同时，此类材料具有吸收峰宽、激发光谱连续分布、荧光强度高和斯托克斯位移大的特点，因此可以实现同一束光激发下，不同粒径量子点均可以得到激发，达到同时多目标检测的效果[36-39]。段宏等[40]开发的检测恶性疟原虫的免疫层析试纸条使用羧基化量子点，产生了普通量子点2 800倍的荧光强度，单个样品15 min内检测最低灵敏度可达5.8 Parasite/μL；孙洁等[41]针对H5亚型禽流感病毒，用量子点标记特异性单抗，基于夹心法原理制备的检测H5亚型禽流感病毒的试纸条的标准抗原最低检测量可达1 μg/L，是市售同类胶体金试纸条灵敏性的100倍，与商品化试剂盒符合率高(99.8%)，特异性好，为H5亚型禽流感病毒的检测提供了良好基础；XU等[42]开发的检测四环素的免疫层析方法，被验证具有出色的抗干扰能力，可以对牛奶、河水样品进行准确检测；蔡甜等[43]开发的检测肺炎支原体早期感染产生的IgM抗体的免疫层析方法通过量子点标记，对200例临床样品进行检测，符合率可达91.25%，对早期诊断有着重大意义。

2.2.4纳米模拟酶免疫层析 纳米模拟酶(nanozymes)是近几十年间成功合成并发展的一类兼具了纳米材料特点与酶的催化功能的模拟酶，与辣根过氧化物酶的催化作用类似，在生物传感、免疫测定、医学治疗及去除污染等许多领域中都有广泛的应用[44]。常见的材料有Fe3O4、钯、金、硒等。PARK等[45]开发的基于荧光富勒烯(fullerene)材料的检测血清C-反应蛋白(CRP)的免疫层析方法可以在短时间内定量地对0.1～10.0 μg/L的CRP进行检测，对疾病的诊断和预后评估有重要意义。金纳米酶可以通过铜沉积现象放大反应信号。田美玲[46]通过试验验证，使用金纳米酶的试纸条相比于传统胶体金试纸条的检测限降低了2～3个数量级。JINMEI 等[47]开发了两步级联纳米酶免疫层析试纸条检测牛奶中大肠杆菌O157:H7，放大信号后的试纸条的灵敏度得到显著提升，检测限可达1.25×101CFU/mL，是传统胶体金方法的400倍。

2.3 结合新技术的免疫层析免疫层析技术最初仅能定性地通过TL、CL的显示情况进行检测，随着技术的发展和联动，除了前文提到过的配置读卡仪测量灰度进行定性分析的检测方法外，还有结合聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、重组聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)、杂交链式反应(hybridization chain reaction,HCR)和环介导等温扩增反应(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)等开发的免疫层析试纸条也逐渐被发展起来。此类试纸条不再局限于检测抗原/抗体等血清学指标，而是可以在核酸层面对样品进行检测，因此具有相对传统胶体金免疫层析法(GICA)来说更高的灵敏性和特异性。

近年来，RPA技术与LFIA的联用频繁出现。SAFENKOVA等[48]的研究证明，在控制DNA片段长度的前提下，RPA-LFIA可以显示出更高的灵敏度；ZHAO等[49]首创的检测牛支原体的RPA-LFIA经过验证，与实时荧光定量方法符合率高，且检测时间仅需30 min；万文妍等[50]结合了RPA技术与胶体金试纸条，用RPA扩增产物为样品成功建立了兼具两种技术优点的快速检测禽腺病毒血清4型的方法，更加适用于临场检测；同样地，在猪圆环病毒病防控方面，YANG等[51]开发的RPA-LFIA方法与实时RPA相比，灵敏度相当而检测时间更短。

在其他技术方面，陈诗胜等[52]结合PCR技术，开发了检测无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和停乳链球菌4种可致奶牛乳房炎的病原菌的免疫层析方法，通过检测模拟样品，显示试纸条特异性良好且比凝胶电泳更灵敏；宋广萍[53]利用HCR放大信号，设计开发了3种可视化检测H1N1亚型流感病毒的GICA，其中，利用双链特异性核酸酶(duplex-specific nuclease,DSN)结合HCR，双重放大信号，建立的检测方法检测限可以达到3.12 fmol/L；在食品安全方面，JIANG等[54]开发的LAMP-LFD，可以同时检测配方奶粉中3种食源性病原体，且不需特殊技术预先富集即可达到灵敏检测；在疟疾的体外快速诊断方面，LAMP-LFIA显示出高灵敏度，检出限可达0.01 μg/ L，在没有足够条件的环境中，具有巨大的应用潜力[55]。同样的研究也见于JIAO等[56]对检测结核分枝杆菌的免疫层析技术的开发，基于多交叉置换扩增技术(multiple cross displacement amplification,MCDA)与侧向层析技术制备相结合得到了新型方法，即MCDA-LFIA，全过程仅需50 min，检测限可达10 fg，在灵敏性和特异性评价方面表现优秀，简单的操作和容易达到的反应条件对设备和人员要求较低，适用于结核病的早期诊断。

3 展望

免疫层析技术自诞生以来，由于成本较低、样品处理简单、操作方便易行和反应迅速，同时还兼具灵敏方便等优点，现被广泛应用于医学研究、疾病防控和食品安全检测等多个方面。在特性上，显示结果的指标较为单一、不同批次原料可能存在的差异和保存条件等因素固然是胶体金免疫层析技术的短板，使得单纯的胶体金免疫层析技术受限于自身条件，在高精度的检验和定量检测方面存在一定不足，通常用于初步筛查和定性检测；但由于其相对简单的制备过程和操作方法，作为一类快速检测技术，相比于其他方法而言胶体金免疫层析具有耗时更短、操作更简单并具有一定的灵敏性和特异性等不容忽视的优点，它在当前的快速诊断领域仍是不可替代的[57]。在最近发生的新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)疫情中，截至2020年3月30日，国家药监局批准通过的8个新冠病毒抗体检测产品中胶体金免疫层析方法达5个之多，这是胶体金方法制备简单、检测性能良好的体现，对目前新冠疫情的快速体外临床诊断具有重大意义。

同样地，近年来的各类新型材料、新型仪器和新兴技术的发展也给免疫层析技术和以胶体金为探针的检测技术带来了更多可能。胶体金定量分析仪可以对胶体金试纸条的显色情况进行比较和评价，它的出现与普及使得普通试纸条的定量或半定量检测得到突破，手持式的仪器使用便捷、检测迅速，将简单的显色情况转化为具体数值更便于分析[58]；新的标记材料正在逐步取代胶体金颗粒作为标记物，使得检测结果不仅具有可视性，还具备可量化性，更有利于检测人员对结果的量化分析走向精细化、准确化；与其他检测技术，如PCR等的联合应用增加了胶体金的检测灵敏度，检测对象也不再局限于抗原和抗体，而是可以达到核酸层面，使体外诊断结果更加准确[59]。在国内外科研人员的共同努力下，免疫层析技术的开发更加全面、应用更加广泛；同时，由于现代互联网技术的发展和大数据的覆盖，适合临场初筛检测的免疫层析试纸条可以提供大量的检测信息，这类数据结合云端分析的应用，可以更好地为医疗人员因地制宜地选择治疗措施和制定防控方案等提供参考，也有利于进行流行病学调查[60-62]。

综上所述，免疫层析技术已经在向更精细、更准确、操作更简单的方向不断发展，传统原理与各类新型检测技术的结合是新趋势，也是技术发展下的必然结果。伴随着新材料、新技术、新仪器与新观念的联用融合，免疫层析技术必将进一步完善和发展，在各类临床检测方面将有更广阔的用武之地。