癫痫伴发抑郁大鼠杏仁核突触相关蛋白的表达

曹真真， 闫桂柳， 朱含笑， 李漾超， 李 云

癫痫(epilepsy)是一种大脑神经元突发异常放电，发作具有重复性、发作性、短暂性、刻板性特点的神经系统疾病[1]。抑郁(depression) 是以情绪低落为主要表现的社会功能障碍性疾病。癫痫伴发抑郁(epilepsy-associated depression,EAD)是癫痫患者常见的并发症之一。Fiest等发现癫痫患者中，抑郁患病率高达23.1%，而终身抑郁症患病率达4.1%～32.5%[1]。近年来，EAD的发病率仍在持续升高，抑郁对于患者的影响远远大于癫痫本身，不仅影响患者的生存质量，而且加重家庭经济负担，甚至导致患者自杀。现已有研究认为，癫痫与抑郁发病机制存在潜在共同点，但具体机制并不明确。

近年来研究突触可塑性及其相关蛋白与神经精神障碍性疾病的相关性的报道越来越多，多种突触相关蛋白能够协同维持突触的功能及调控神经递质的释放，从而影响神经精神疾病的发病[2]。神经生长相关蛋白(Growth-associated protein-43，GAP-43)是一种神经组织上的特异性磷蛋白。突触素(Synaptophysin，SYN)是作为突触发生和突触重塑的重要标记的一种钙结合糖蛋白[3]。突触后致密蛋白(Postsynaptic density95，PSD95)是突触后致密物质的主要蛋白质成分之一，也是包含高浓度谷氨酸受体、信号蛋白、细胞骨架元素的一种有机结构[4]。既往有研究发现，突触相关蛋白GAP-43、SYN、PSD95在癫痫发病过程中表达水平明显下降，这提示GAP-43、SYN、PSD95在癫痫的发生机制中起重要作用。本课题组前期的研究发现，脑源性神经营养因子(brain derived neurotrphic factor,BDNF)及其受体TrKB在癫痫伴抑郁发病中具有重要作用，已知BDNF可促进损伤神经元的再生，并参与突触重塑和神经递质传递的功能，在癫痫伴抑郁的发病过程中发挥了重要作用[5,6]。但突触相关蛋白对于癫痫伴抑郁的影响相关文献仍较少。基于上述事实，本课题拟进一步探讨EAD大鼠杏仁核突触相关蛋白的表达变化，以阐述突触相关蛋白与EAD发病的关系。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂 选用健康清洁级成年SD大鼠，体质量(250±50)g，由大理大学动物实验中心提供[动物质量合格证: SYXK(滇) 2018.0002]。实验过程中，对动物的处置符合大理大学第一附属医院伦理委员会关于使用实验动物的伦理学标准。实验中使用的免疫组织化学染色试剂包括试剂一(3%内源性过氧化氢酶阻断剂)、试剂二(反应增强剂)、试剂三(增强酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物)，一抗为(GAP-43、SYN、PSD95)和羊血清，其中一抗与磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution,PBS)按1∶100配制，GAP-43、SYN、PSD9购自Millipore公司，PV900试剂盒(北京中杉)，羊血清购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠模型及分组 本实验于 2019年1月-2020 年12月在大理大学科研实验中心完成。采用Open-field法进行行为学评分，筛选评分大致相似的大鼠，随机将成年SD大鼠分为4组，正常组、抑郁组、共病组、癫痫组。正常组:大鼠正常条件饲养;抑郁组:采用慢性不可预见的中等应激刺激动物(chronic unpredictable mild stress,CUMS)结合孤养法建立大鼠慢性应激抑郁模型[7];癫痫组和共病组:参考文献[8]建立成熟的氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠模型，建模过程为:予大鼠腹腔注射氯化锂(3 mmol/kg)，20 h～24 h后腹腔注射匹罗卡品(10 mg/kg)，30 min后未达到癫痫发作的大鼠，再次给予匹罗卡品(10 ml /kg)，至极量为60 mg/kg，直至大鼠出现Ⅳ级以上的癫痫大发作。大鼠出现Ⅳ级以上的发作并持续 60 min 定为模型制作成功的标准，同时给予腹腔注射地西泮(4 mg/kg)控制发作，以防止大鼠抽搐过度致死。癫痫模型造模后14 d，对大鼠进行筛选，将符合抑郁指标的大鼠作为共病组，每笼1只饲养。造模成功后，各组大鼠常规腹腔注射青霉素预防感染。实验大鼠均成功造模和存活。

1.2.2 大鼠造模成功的标准 癫痫模型建立后，采用Racine评分标准评级癫痫行为:0 级:无任何反应;Ⅰ级: 面部抽搐，包括眨眼、动须、节奏性咀嚼等;Ⅱ级:Ⅰ级行为表现加节律性点头;Ⅲ级:Ⅱ级行为表现加前肢肌阵挛，但无后肢直立位;Ⅳ级:Ⅲ级行为表现加后肢直立位;Ⅴ级: 全面性强直-阵挛发作，并失去肢体控制。大鼠出现Ⅳ级以上的发作时间大于60 min，并持续发作，毛发失去光泽，体质量减轻，活动减少，蜷缩少动，快感缺失，自发活动和探究性活动减少则可认为EAD造模成功。动物行为学评价：(1)体重的测量：监测癫痫大鼠在癫痫发作后第1天、第8天、第15天、第29天及各对照组大鼠同一时间点体重变化情况;(2)蔗糖水试验： 癫痫大鼠在造模后第1天、第8天、第15天、第29天及各对照组大鼠，每隔1 w进行禁水24 h，测定禁水24 h后的第1小时内动物饮用1%蔗糖溶液的量(蔗糖溶液的饮用量反映了大鼠对奖赏的快感反应)；(3)旷野试验：拟用敞箱长宽均为 100 cm、高为 50 cm，内空的立柱体，壁周为黑色，地面用黑线划分为面积相等的25块。以动物穿越地面方块数(四爪跨入)作为水平活动得分(反映大鼠的运动活动性水平)，以直立次数(两前肢离地1 cm以上)为垂直活动得分(反映大鼠兴趣减少程度)。行为学评价结果显示: 应激后各组大鼠不同时间比较体质量减轻、蔗糖溶液消耗量减少、旷场实验水平运动距离及垂直运动距离缩短(P<0.05)；在CUMS 后第29天与1 d、8 d、15 d比较，抑郁组、共病组大鼠以上各指标降低(P<0.05)(见图1)，则进一步说明EAD模型建立成功。

1.2.3 组织制备 各组大鼠分别于造模成功后第29天取材，采用活体灌注固定取脑法取脑组织。免疫组织化学染色法检测杏仁核突触相关蛋白(SYN、PSD95、GAP43)，抗体浓度为1%:用3.6%水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔麻醉大鼠，首先用生理盐水从左心室开始灌洗，然后灌注4%多聚甲醛，断头取脑，并于冠状面上切取大鼠大脑杏仁核0.5 cm，用冰冻石蜡切片机连续冠状切片，片厚约8 μm。免疫组化二步法进行检测，最后采用光学显微镜拍照，在每只动物杏仁核区选择高倍视野(HPF，400×)，计数突触相关蛋白(GAP43、SYN、PSD95)免疫阳性细胞数量。

1.2.4 免疫组织化学染色 将上述切片自然干燥，放入60 ℃烤箱烤2.5 h后，自然降温，再次放入65 ℃烤箱烤30 min，经二甲苯脱腊、梯度乙醇水化、高压修复后冷却，使用磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution,PBS)漂洗，使用内源性过氧化氢酶阻断剂阻断内源性过氧化物酶后，再次使用磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution,PBS)漂洗，使用羊血清封闭非特异性的抗原抗体反应1 h后，加入一抗-4 ℃过夜，次日磷酸盐缓冲(Phosphate buffer solution,PBS)充分漂洗后滴加反应增强剂室温孵育30 min，再次磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution,PBS)充分漂洗后加入适量新鲜配置的DAB显色，自来水冲洗后，使用苏木素染色液复染，梯度酒精脱水后，二甲苯透明、中性树胶封片。每只大鼠选不连续的5张切片，采用光学显微镜进行拍片。每张切片400×拍照5个视野，双盲计数杏仁核免疫阳性细胞数。

2 结 果

2.1 各组大鼠杏仁核突触相关蛋白(GAP43、SYN、PSD95)免疫阳性细胞定位表达情况 光学显微镜显示，各组大鼠大脑杏仁核均有突触相关蛋白GAP43、SYN、PSD95的表达，3种因子免疫阳性细胞呈棕黄色，定位在神经元胞质及突起根部。

2.2 各组大鼠杏仁核突触相关蛋白(GAP43、SYN、PSD95)免疫阳性细胞数对比 单因素方差分析(one-way ANOVA)结果显示，与各对照组相比，共病组GAP-43及PSD95免疫组化阳性细胞数最少，正常对照组最多(P<0.05)；其余各组相比差异无统计学意义(P>0.05)。共病组和抑郁组与癫痫组及正常组相比，SYN免疫组化阳性细胞表达均减少(P<0.05)；癫痫组较抑郁组增多，较正常组减少(P<0.05)(见表1、图2)。

表1 各组大鼠大脑杏仁核GAP-43、SYN、PSD95免疫阳性细胞数比较

与正常组同时间比较▲P<0.05；与癫痫组同时间比较▽P<0.05

各组大鼠杏仁核阳性细胞表达变化：A:正常组GAP43阳性细胞表达；B:抑郁组GAP43阳性细胞表达；C:癫痫组GAP43阳性细胞表达；D:共病组GAP43阳性细胞表达；E:正常组PSD95阳性细胞表达；F:抑郁组PSD95阳性细胞表达；G:癫痫组PSD95阳性细胞表达；H:共病组PSD95阳性细胞表达；I:正常组SYN阳性细胞表达；J:抑郁组SYN阳性细胞表达；K:癫痫组SYN阳性细胞表达；L:共病组SYN阳性细胞表达

3 讨 论

杏仁核位于大脑边缘系统，是参与情绪调节的重要结构，在识别、评估情绪刺激以及针对刺激产生的特定情绪中发挥关键作用[9,10]。Richardson等[11]研究发现杏仁核体积的改变在EAD的发病中起关键作用。本团队前期的实验发现EAD模型大鼠杏仁核中有大量神经元凋亡的现象[5]，由此可见杏仁核与EDA的发生密切相关。越来越多的研究发现，EAD的发生机制可能与神经突触可塑性的改变相关。GAP-43是存在于神经细胞膜上的一种特异性磷酸蛋白，主要分布于大小脑、脊髓、背根节以及自主神经系统的神经元内,并且只存在于已分化成型且开始突触生长的神经元中[12]。GAP-43对于突触功能的维持、轴突生长及神经递质的释放起着关键作用[13]，同时也是神经元生长和发育的内在决定因子之一[14]。SYN是一种特异性钙结合酸性蛋白[15]。主要表达于中枢和外周神经系统所有神经末梢，同时在神经内分泌细胞也可见部分表达[16]。最近研究表明，SYN不仅调节成熟神经末梢的神经递质的释放，同时调节神经末梢的形成和生长，SYN在囊泡融合和神经递质的释放中起着关键作用[17]。张明磊等[3]研究中提到SYN通过酪氨酸激酶使突触素磷酸化调节神经递质的释放，从而影响突触可塑性。PSD是一层均质的存在于突触后膜内侧胞质面的物质，对于突触可塑性至关重要，而PSD95是兴奋性突触后致密物质(PSD)中的含量丰富的重要蛋白之一。PSD95被认为是兴奋性突触的突触后特异性标记物，同时能够促进谷氨酸受体的传递和参与抑郁症的发病[18]。目前杏仁核中突触相关蛋白GAP-43、SYN、PSD95是否在EAD中发挥重要作用未见相关报道。

GAP-43、SYN、PSD95与抑郁症的发病密切相关。Lang等[19]提到，抑郁症的神经营养假说认为情绪和记忆相关的脑区神经可塑性降低、神经元萎缩和神经发生异常能够影响抑郁状态的发生。同时大量证据表明，抑郁症可以导致突触的形式和功能发生了区域特异性变化，突触相关蛋白的表达发生了改变[20]。综上所述，GAP-43、SYN、PSD95均可影响突触可塑性，从而影响抑郁症的发病。LUO等人[21]的研究发现，慢性不可预见性温和应激大鼠表现出抑郁行为与杏仁核PSD-95及SYN表达显著减少相关。本研究结果显示，与正常组对比，抑郁组及共病组杏仁核GAP-43、PSD95及SYN免疫阳性细胞数表达均低于正常组，共病组与抑郁组SYN比较免疫阳性细胞表达增加，而共病组与抑郁组GAP-43、PSD95比较差异无统计学意义，提示在抑郁大鼠中杏仁核GAP-43、PSD95及SYN表达降低，则杏仁核GAP-43、SYN、PSD95降低可能提示EAD的发病。

在刘杰等[22]的研究中的实验造模成功后采用RT-PCR 检测方法发现15 d 时发作组GAP-43 mRNA的表达明显高于其他对照组，但癫痫状态逐渐稳定后，随着苔藓纤维出芽、突触重塑停止，至30 d时GAP-43 mRNA的表达明显下降。这表明GAP-43的表达下降与大鼠癫痫发作相关。文献报道[15]，SYN与神经纤维出芽和突触重塑的关系密切，从而参与癫痫的发病。张杰等[23]实验中发现，氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠模型中PSD95表达下调，提示PSD95在癫痫的发病中发挥重要作用。综上所述，突触相关蛋白GAP-43、SYN、PSD95在癫痫的发病机制中发挥重要作用，并影响其发病。本研究结果显示，与正常组对比，癫痫组与共病组杏仁核GAP-43、PSD95及SYN免疫阳性细胞数表达均减少，共病组与癫痫组对比SYN免疫阳性细胞表达升高，而共病组与癫痫组比较GAP-43、PSD95比较差异无统计学意义，癫痫大鼠杏仁核中GAP-43、SYN、PSD95表达的降低提示可能与EAD的发病相关。

综上，本研究结果为进一步深入探讨突触可塑性在EAD发病机制及阐明杏仁核在PSD发病中的作用提供了实验依据。后续研究需进一步探讨EAD大鼠杏仁核突触相关蛋白GAP-43、SYN、PSD95蛋白的定量表达及模型大鼠行为学改变情况信号通路的表达情况。