姜黄素对脑出血模型大鼠认知功能以及海马区细胞凋亡的影响

徐 鹏， 叶 芸， 乔 鹏

脑出血危害人类健康的重大疾病，因脑出血引发的痴呆发生率很高(从5%～44%不等)。研究发现，脑出血后的认知功能障碍既包括急性出血性病变导致的即刻认知功能障碍，也包括弥漫性血管和非血管病变缓慢积累导致的进行性认知功能障碍[1]。Charlotte Cordonnier等对417例脑出血患者进行研究发现，16%的患者存在既存性痴呆，在重度脑出血患者中，既往痴呆的发生率高达23%[2]。脑出血患者中较高的既往痴呆发生率可能是由潜在的淀粉样变病理所致[3]，其病变在大脑中海马区的损伤最为重要。

海马神经元凋亡在脑出血、血管性痴呆、阿尔茨海默病发病中均起着重要的作用[4]。神经元凋亡受多种因素影响，如Bcl-2、Bax、caspases、活性氧(ROS)等。Bcl-2和caspases-3是已被认知的两个参与细胞凋亡的关键调控分子，抑制Bcl-2的表达，提高Bax的表达可以激活p53和caspases-3，将诱导大鼠海马神经元凋亡[5～7]。

姜黄素是从姜黄中分离得到的一种天然多酚类物质。大量研究表明，姜黄素具有抗氧化、抗炎、免疫调节和神经保护活性等生物学和药理特性，被认为是一种潜在的治疗延迟和治疗各种与年龄有关的慢性疾病的药物，越来越受到人们的关注[8～10]。然而目前对姜黄素参与调控海马神经元凋亡因子表达和学习记忆能力的影响却少有报道。

为了寻找更有效、毒性更小的新型抗脑出血的药物或营养补充剂，本研究选用姜黄素作为活性因子，建立脑出血大鼠模型来评价姜黄素对脑出血大鼠模型的认知和海马区细胞凋亡作用及探索其作用机制，探索姜黄素辅助治疗是否可以替代传统药物对脑出血引发的功能损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 动物试验根据实验动物使用指南进行，实验方案已得到动物护理和使用委员会的批准。在本研究中选用从北京维通利华实验动物技术有限公司购买的24只12个月大的C57BL/6雄性大鼠作为研究对象，在这个年龄大鼠衰老的脑血管作用已经完全发育成熟，饲养过程中维持12 h的光/暗循环，并且可以自由获得水和食物。

1.2 试剂与仪器 Aβ25-35 (批号:Y-0044) 购买于BIOSS生物科技有限公司(北京，中国)；TUNEL凋亡检测试剂盒购买于BOSTER生物科技有限公司(武汉，中国)；An RT-PCR试剂盒购买于TransGen生物科技有限公司(北京，中国)；Anti-Bcl-2、anti-Bax与anti-β-actin抗体购买于Bio-Rad实验室(伯克利，美国)；MT-2000Morris水迷宫购买于成都泰盟科技有限公司(成都，中国)；戊巴比妥(批号:76-74-4)、多聚甲醛(批号:30525-89-4)、氯仿(批号:67-66-3)、乙醇(批号:64-17-5)；异丙醇(批号:67-63-0)等常规试剂均购买于美国Sigma公司；LDH 检测试剂盒(建成生物工程研究所，中国)；细胞色素C释放凋亡测定试剂盒(BioVision，美国)；Sepharose凝胶(Invitrogen公司，美国)；紫外分光光度计(Beckman-Coulter DU-640，美国)；DL500 DNA(Invitrogen，美国)；倒置显微镜S70购自Leica DMIRB(Lognes，法国)；ChemiDocXRS凝胶成像分析系统购自Bio-Rad实验室(伯克利，美国)；免疫组化试剂盒购自北京ZSGB生物工程有限公司(中国，北京)；TC-512PCR扩增仪购自Techen(伦敦，英国)。

1.3 脑出血动物建模 用异氟醚麻醉大鼠并放置于立体定向的框架中，在做头皮中线切口之前在头皮下注射利多卡因。试验中使用无菌技术在大鼠前囱的外侧(一半在前囱的左侧，一半在前囱的右侧)和0.0 AP水平处钻一个3.0 mm的孔，将一根26号针插入6.0 mm的深度，分别将1.0 L的无菌生理盐水(n=8)和0.10 U(n=16)细菌胶原酶按常规注射法注入超过5 min，做为假手术组和脑出血患病大鼠[11～13]，针留在原处停留5 min以防止回流，随后缝合伤口。在整个手术和恢复期间，使用直肠温度探头和加热毯，使大鼠体温被维持在37.0 ℃±0.5 ℃。

1.4 实验处理 所有药物治疗均于术后第21天开始，将ICH建模大鼠随机分为两组，一组给予姜黄素(120 mg/kg，480 mg/kg)作为姜黄素(Cur)处理组;另一组作为模型组(0.005%乙醇/生理盐水)。在胶原酶注射前及注射后1 d、3 d分别测量体重。体重变化百分比按公式计算：体重变化百分比(%)=(出血性后各时间点-出血性前体重)/出血性前体重×100。

1.5 Morris水迷宫实验 本研究采用Morris水迷宫法对空间学习记忆能力进行测定。试验是在一个圆形的白色塑料水池中进行(直径94 cm，深度31 cm)，里面装满了水(深度30 cm)和3000 ml脱脂牛奶，测试时温度保持在25 ℃±1 ℃。逃生平台是一个25 cm2的有机玻璃广场，位于游泳池的一个象限的中心，距离泳池边缘15 cm，并淹没在液面下方1 cm。

1.5.1 隐藏的平台测试 每只老鼠头部标注黄色，背带着亚硝基黄原酸，在一个圆形池对小鼠进行训练，一个隐藏的平台将圆形池随机分为4个象限，每次试验120 s，间隔30 min，连续5 d。通过在线图像视频跟踪系统记录大鼠寻找平台的时间，并在120 s内作为逃逸潜伏期。

1.5.2 空间探针实验 隐藏平台实验结束后将平台从池中取出，老鼠被留在距离主平台最远的水池的四分之一处，通过在线图像视频跟踪系统记录大鼠通过平台的次数、平台象限停留时间、平台象限的总距离的百分比。

1.6 神经行为评分 姜黄素处理5 d后，对不同组处理的大鼠的神经行为进行行为评分，具体评分标准如下：0分:无任何神经功能缺损症状；1分：提尾悬空后，大鼠前肢腕肘屈曲，肩内旋，肘外扩，紧贴胸壁，没有其他不正常行为；2分：将大鼠放在光滑的平面上，横向推动大鼠肩部使其向前方移动，肢体阻力减小，同时伴有前肢弯曲动作，无转圈行为；3分：大鼠自由活动时会发生环转或转圈；4分：肢体软瘫，肢体无法进行自发活动。分值越高表明神经功能缺损越严重。

1.7 大鼠海马神经元组织病理学检查 将大鼠腹腔注1.0%的戊巴比妥，灌注4%多聚甲醛固定脑24 h，随后将脑组织取出称重，固定在10%的中性福尔马林缓冲液中，脱水后使用石蜡将其封装在冠状切片中，随后H&E染色，在光学显微镜下(400×)进行病理研究。实验中仔细观察凋亡细胞的明显形态学特征，包括细胞核凝结和碎裂情况。由于凋亡细胞在细胞核内呈褐色，采用石蜡切片TUNEL免疫组织化学染色法相结合计算凋亡细胞指数。凋亡指数的计算方法为随机选取100个神经元细胞中凋亡细胞的百分比，采用GD-10.0图像分析系统计算凋亡细胞阳性率。

1.8 大鼠脑组织RNA分离及caspase-3 mRNA分析 大鼠脑组织麻醉后，注射1.0%戊巴比妥麻醉。按照文献中描述的一般步骤，用TRIzol对组织总RNA进行分离和提取。纯度：A260/280为1.91-2.19，A260/230为1.98-2.31；而浓度> 0.2 μg/μl，使用1 μg RNA进行逆转录生成cDNA。PCR产物在0.1%琼脂糖凝胶电泳的DL500DNA标记，采用β-actin作为空白，凝胶成像后定量分析。

1.9 细胞培养 PC 12细胞购买于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，湖北武汉)杜尔贝克补充5%胎牛血清、10%马血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素，在改良的培养基冲入CO2(5% CO2，37 ℃)培养，每3～5 d更换一次新的培养基。

1.10 Western blotting分析PC12细胞中Bcl-2和Bax蛋白的表达 PC12细胞培养在密度为1.0×105six-well中(2.0 ml)与20 μmol/L Aβ25-35在CO2培养箱中反应12 h以建立的细胞模型，随后将细胞随机分为5组，使用血清DMEM培养基冲洗，培养基(空白)或含有20 μmol/L Aβ25-35的姜黄素(120 mg/kg，240 mg/kg，480 mg/kg)反应12 h，假手术组PC12细胞也用无血清的DMEM培养基冲洗，并作为对照处理组。Bax与Bcl-2蛋白表达量采用Quantity One System，Bcl-2、Bax的比率以Bax/β-actin和Bcl-2/β-actin计算。

2 结 果

2.1 姜黄素对脑出血大鼠空间学习记忆能力的影响 Morris水迷宫试验是被广泛使用的用于评估空间学习和记忆认知的经典方法，在本文中我们采用Morris水迷宫试验对大鼠建模后的空间学习和记忆能力开展了研究，不同处理组在Morris水迷宫中探测的运动轨迹(见图1)。

与假手术组相比，模型组大鼠的逃避潜伏期明显延长(见表1)，而分别给予120、480 mg/(kg·d)的姜黄素(Cur)处理的脑出血大鼠与模型组大鼠相比，2 d后大鼠的逃避潜伏期均显著降低(P<0.01)。此外，与假手术组大鼠相比，模型组大鼠在穿越平台次数、目标象限停留时间、平台象限的总距离的百分比3个方面均明显降低(P<0.01)(见表2)，而Cur处理组与模型组相比显著增加(P<0.01)。这些结果揭示姜黄素能显著提高脑出血大鼠的空间学习和记忆认知能力。

2.2 姜黄素对脑出血大鼠神经元凋亡的影响 脑出血的病理改变和神经元损伤是海马神经元细胞的凋亡关键因素。大鼠海马神经元细胞微观结构及凋亡百分比，假手术组的神经元凋亡比例为(8.1±1.07)%，而模型组高达(65±1.23)%，采用120、480 mg/kg姜黄素处理后神经元凋亡比例下降为(36.50±2.43)%、(15.00±2.51)%，这一结果表明神经元凋亡在脑出血患者中起重要作用，能有效抑制神经元凋亡(见图2)。

2.3 姜黄素对脑出血大鼠神经元组织caspase-3 mRNA、Bax和Bcl-2蛋白表达的影响 对大鼠脑组织RNA分离及caspase-3 mRNA分析，数据显示患病组大鼠神经元组织caspase-3的mRNA表达明显高于假手术组大鼠(P<0.01)。与模型组相比，姜黄素处理(120、480 mg/kg)显著降低了脑出血大鼠caspase-3 mRNA的表达(P<0.01)。试验中进一步通过建立细胞模型评估不同处理对Bax和Bcl-2蛋白表达的影响，以探讨细胞凋亡通路相关的可能机制。研究结果发现，在120 mg/kg、480 mg/kg浓度下姜黄素处理细胞模型12 h，显著下调Bax蛋白的表达水平(P<0.01)并且上调Bcl-2蛋白的表达水平(见表3)。与假手术组相比，模型组Bcl-2/Bax的相对比例显著下降(P<0.01)，而经120 mg/kg、480 mg/kg浓度姜黄素处理后，这一比值由0.3显著提高至0.7、1.4(P<0.05)。这些结果表明，姜黄素的抗脑出血作用可能与Bax和Bcl-2的蛋白表达参与抑制细胞凋亡的机制相关。

表1 姜黄素对逃避延迟的影响

表2 姜黄素对穿越平台次数的影响

表3 姜黄素对蛋白表达的影响

3 讨 论

脑出血是一种致命的卒中，不仅会导致患者死亡，还是会对幸存者造成长期的神经或认知损伤，现阶段用于脑出血治疗的药物只能缓解患者的症状，并不能起到延缓病的发展或治愈疾病的功效，目前仍缺乏有效的治疗方法。为了寻找更有效、毒性更小的新型抗脑出血的药物或营养补充剂，本研究选用姜黄素作为活性因子，建立脑出血大鼠模型来评价姜黄素对脑出血大鼠模型的认知和海马区细胞凋亡作用。研究结果发现，Morris水迷宫试验证实与患病组大鼠相比，姜黄素处理的大鼠具有较短的脱逃潜伏期，穿越平台次数、平台象限停留时间、平台象限的总距离的百分比显著增加，姜黄素能改善脑出血大鼠的认知功能。

从脑出血动物模型的基础研究和临床资料中积累的证据表明，神经元损伤和丢失是神经元凋亡的关键因素，细胞凋亡阿尔茨海默病和其他许多慢性神经退行性疾病中患者的神经系统发育起着重要作用，细胞凋亡主要通过线粒体途径和外源性途径两种途径(死亡受体介导)通路。固有的凋亡过程发生在线粒体中，主要影响Bcl-2家族和caspases[14,15]。细胞凋亡的外在途径包括死亡信号的相互作用(如TNF-α TNFR1)和caspase-8裂解procaspase-3使其激活。Bcl-2家族由促凋亡蛋白(Bax、Bad和Bak)和抗凋亡蛋白(Bcl-2和Bcl-xL)组成。不良反应可增加线粒体通透性，释放促凋亡因子，并通过抑制抗凋亡的Bcl-2家族蛋白触发caspase信号通路，进而导致神经元凋亡。促凋亡蛋白(如Bax)与抗凋亡蛋白(如Bcl-2)的比例直接决定了细胞线粒体外膜各通道的开放程度和对凋亡的调控。Caspase-3是细胞凋亡的重要调控因子，其激活被认为是细胞凋亡过程中的关键步骤。活化的caspases裂解多种靶蛋白，导致细胞中DNA片段的破坏，最终导致细胞的凋亡。

本研究发现，神经元细胞凋亡在脑出血的发病机制中扮演着重要角色，姜黄素可以显著抑制神经细胞凋亡。此外，我们还分析了神经组织caspase-3 mRNA和Bcl-2在PC12细胞中的表达，结果表明患病组caspase-3表达显著增加，而姜黄素能显著降低患病鼠caspase-3 mRNA和Bax蛋白的表达，同时增加Bcl-2/Bax的比值和Bcl-2蛋白的表达，这些研究结果揭示姜黄素可通过抑制神经元凋亡信号通路改善脑出血模型大鼠认知功能，预防神经元损伤。但目前尚不清楚姜黄素对大鼠神经元的保护作用是直接通过调控凋亡通路发挥作用还是通过细胞凋亡后IR的进一步改善来实现的，这部分机制需要进一步开展相应的研究。

然而，姜黄素对caspase-3、Bax、Bcl-2表达的显著影响显示，姜黄素的抗脑出血作用也可能与线粒体通透性、CytC、PI3K/Akt信号通路有关。因此，后续研究仍需进一步开展姜黄素对神经退行性变中神经元凋亡相关分子通路的作用机制工作。

图1 不同处理组在Morris水迷宫中探测的运动轨迹。A、B、C、D分别为假手术组、模型组、Cur 120 mg/kg处理组、Cur 480 mg/kg处理组

图2 不同处理对大鼠海马神经元细胞凋亡的影响。A、B、C、D分别为假手术组、模型组、Cur 120 mg/kg以及Cur 480 mg/kg处理组细胞凋亡微观结构