牛源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药性分析

王丽娟，王宁宁，王 乐，李 芬,2，刘晓强，王 妍，李勤凡,2

(1 西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100；2 新疆农业大学 动物医学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

大肠杆菌是常见病原体，尤其是在水清洁度不够及畜舍卫生条件差的养殖场[1]。粪便中的大肠杆菌易通过气溶胶扩散到外部环境，污染附近的空气、水和土壤，进一步对公共环境和人类健康构成潜在威胁[2]。氟喹诺酮类药物(fluoroquinolones，FQs)作为一类广谱抗生素，在治疗由革兰氏阴性菌引起的疾病中发挥着重要作用[3]。然而，FQs的广泛使用和滥用，导致耐药大肠杆菌出现和快速传播[4]。细菌耐FQs的最常见机制包括喹诺酮耐药决定区(quinolone resistant determining region，QRDR)基因突变和质粒介导的喹诺酮类耐药(plasmid-mediated quinolone resistant，PMQR)基因流行[5-6]。对大肠杆菌而言，耐FQs的原因主要是QRDR突变，尤其是gyrA和parC基因编码的氨基酸突变[7]。PMQR基因最早于1998年被发现[8]，研究表明，qnrS、aac(6′)-Ib-cr是最常见的PMQR基因[2,9]。虽然PMQR基因仅赋予大肠杆菌低FQs抗性，但其在肠杆菌中可以水平扩散，并且被认为是QRDR突变产生的有利条件[10]。

由于PMQR基因可以通过相互接触、水及土壤污染从动物传播给人类，同时该基因可以增加QRDR的突变机率，因此其对人或动物大肠杆菌病的防治有重要影响。目前，关于牛源大肠杆菌PMQR基因和QRDR突变的检测研究较少。本试验从犊牛粪便分离鉴定大肠杆菌，通过测定其对3种常用FQs的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，检测PMQR基因与QRDR突变，为合理用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样品采集 选取陕西宝鸡、渭南、咸阳和杨凌4个规模化奶牛养殖场的腹泻犊牛进行采样。首先对犊牛肛门周围进行消毒，随后用无菌棉签采集腹泻犊牛直肠内粪便，将沾有粪便的棉签放入无菌离心管保存，立即低温运输至实验室进行大肠杆菌分离。

1.1.2 药物和试剂 恩诺沙星(ENR)、环丙沙星(CIP)和诺氟沙星(NOR)，购自索来宝公司；麦康凯琼脂培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司；酵母提取物、胰蛋白粉、氯化钠购自OXOID公司；琼脂糖购自Hydra Gene公司；DL2000 DNA Marker和2×rTaqMix购自TaKaRa公司；大肠杆菌ATCC 25922购自杭州滨和微生物有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验 将粪便样品稀释并涂布至麦康凯培养基上，37 ℃培养24 h，挑取粉红色菌落进一步分离和纯化，最后使用大肠杆菌phoA基因特异性引物[11](表1)进行鉴定。PCR反应体系为：菌液2 μL，上游引物(F)0.5 μL，下游引物(R)0.5 μL，2×rTaqMix 10 μL，双蒸水7 μL，总体积 20 μL。将菌液替换为双蒸水设立阴性对照，其他体系不变。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃终延伸10 min。对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。分离的大肠杆菌用体积分数25%甘油于-80 ℃保存备用。以大肠杆菌ATCC 25922作为质控菌，根据美国临床实验室标准委员会(CLSL)推荐的微量肉汤稀释法[12]，测定ENR、CIP、NOR 3种FQs对大肠杆菌分离株的MIC。3种FQs的MIC耐药折点分别为：恩诺沙星(ENR)≥2 μg/mL，环丙沙星(CIP)≥4 μg/mL，诺氟沙星(NOR)≥16 μg/mL。

1.2.2 牛源大肠杆菌PMQR基因及QRDR突变的检测 本试验涉及的PMQR基因包括qnr家族基因qnrA、qnrB、qnrD和qnrS，氨基糖苷乙转移酶基因aac(6′)-Ib和喹诺酮类药物特异性外排泵基因qepA；QRDR突变基因包括编码DNA旋转酶的gyrA和编码拓扑异构酶Ⅳ的parC。备检基因引物序列[13]由生工生物工程股份有限公司(生工)合成(表1)。PCR反应体系及阴性对照的设立同1.2.1节。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸15～40 s(gyrA17 s，parC17 s，qnrA38 s，qnrB30 s，qnrD35 s，qnrS40 s，aac(6′)-Ib30 s，qepA15 s)，30个循环；72 ℃终延伸10 min。对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。将aac(6′)-Ib基因PCR产物送生工进行测序，并通过NCBI网站比对确定其亚型(aac(6′)-Ib-cr)。将gyrA和parC的PCR产物送至生工进行测序，将测序所得核酸序列通过ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)翻译为氨基酸序列，并通过DNAMAN软件与NCBI数据库录入的E.coli-k12的gyrA和parC氨基酸序列进行比对，分析QRDR突变情况。

表1 试验所用引物的信息Table 1 Sequences of primers used in this study

1.2.3 恩诺沙星(ENR)诱导试验 选取携带PMQR基因且QRDR未突变(2株)、不携带PMQR基因且QRDR未突变(2株)的大肠杆菌在含ENR的LB液体培养基中进行诱导，ENR初始诱导质量浓度为0.25 μg/mL，若菌株生长良好，第2天ENR浓度2倍递增继续诱导，以此类推直至第10天；以在不加ENR的LB液体培养基中培养至第10天的菌株作为对照。PCR扩增诱导和对照菌株的gyrA、parC基因，将PCR产物送至生工测序后比对分析gyrA和parC基因是否发生突变。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌的鉴定及药敏试验结果

试验共分离到75株菌，经PCR检测均扩增到468 bp的phoA基因，故确定其均为大肠杆菌，部分大肠杆菌phoA基因的鉴定结果见图1。

M.DNA Marker；1～8.分离菌株；9.阴性对照M.DNA Marker；1-8.Isolated strains；9.Negative control图1 牛源分离菌株phoA基因的PCR扩增(部分结果)Fig.1 PCR amplification of phoA gene from bovine isolated strains (partial results)

MIC试验结果(表2)表明，60.00%(45/75)的菌株对至少2种FQs耐药，其中40.00%(30/75)的菌株对ENR、CIP、NOR均耐药，且对ENR的耐药程度较为严重(60.00%)。

2.2 PMQR基因及QRDR突变检测结果

PMQR基因PCR扩增结果表明，75株大肠杆菌均未检测到qnrA、qnrD、qepA，检测出qnrS(642 bp)、aac(6′)-Ib亚型aac(6′)-Ib-cr(482 bp)和qnrB(469 bp)，部分菌株的PMQR基因检测结果见图2。61.33%(46/75)的大肠杆菌菌株至少携带1个PMQR基因，其中以qnrS(45.33%，34/75)和aac(6′)-Ib-cr(21.33%，16/75)最为常见(表2)。

M.DL2000 DNA Marker；1,2.qnrS基因；3,4.qnrB基因；5,6.aac(6′)-Ib-cr基因；7.阴性对照M.DL2000 DNA Marker；1，2.qnrS gene；3，4.qnrB gene；5，6.aac(6′)-Ib-cr gene；7.Negative control图2 牛源大肠杆菌PMQR基因的PCR扩增(部分结果)Fig.2 PCR amplification of PMQR gene from bovine E. coli (partial results)

GyrA和ParC氨基酸序列比对分析的部分结果如图3所示。

a.ParC氨基酸比对；b.GyrA氨基酸比对。1.E.coli-k12；2～10.不同的菌株。S.丝氨酸，D.天冬氨酸，L.亮氨酸，N.天冬酰胺，Y.酪氨酸，I.异亮氨酸，E.谷氨酸，G.甘氨酸a.ParC amino acid alignment;b.GyrA amino acid alignment.1.E.coli-k12；2-10.Different strains.S.Serine；D.Aspartic acid，L.Leucine，N.Asparagine，Y.Tyrosine，I.Isoleucine，E.Glutamic acid，G.Glycine图3 牛源大肠杆菌parC和gyrA基因编码氨基酸的突变分析(部分结果)Fig.3 Mutation analysis of amino acids encoded by parC and gyrA genes from bovine E.coli (partial results)

由表2可知，58.67%(44/75)的大肠杆菌发生了QRDR突变；43株菌发生了GyrA氨基酸的突变，其中90.70%(39/43)为Ser83Leu+Asp87Asn突变，6.70%(3/43)为Ser83Leu+Asp87Tyr突变，2.33%(1/43)为Ser83Leu单突变；43株菌发生了ParC氨基酸突变，其中93.02%(40/43)为Ser80Ile单突变，6.98%(3/43)为Ser80Ile+Glu84Gly突变。在发生QRDR突变的大肠杆菌中，有95.45%(42/44)的菌株同时发生了GyrA和ParC氨基酸突变，其中最常见的突变组合为GyrA:(Ser83Leu+Asp87Asn)+ParC:Ser80Ile。

表2 75株牛源大肠杆菌的耐药表型、PMQR基因及QRDR突变检测结果Table 2 Results of resistant phenotypes,PMQR genes,and QRDR mutations in 75 E.coli strains

分析75株大肠杆菌的耐药表型与PMQR基因及QRDR突变的关系，结果表明发生QRDR突变且携带PMQR基因的菌株对ENR、CIP、NOR均耐药；PMQR基因单独存在的菌株耐药性不强，但是QRDR突变与PMQR基因共存时，NOR、ENR和CIP的MIC较仅发生QRDR突变的菌株分别增加了4～32，4～16和2～16倍(表2)。

2.3 恩诺沙星诱导结果

恩诺沙星(ENR)诱导试验结果表明，携带PMQR基因且QRDR未突变的1株菌，在ENR诱导第2天时gyrA基因第521、539位的碱基由T变为C，另1株菌在诱导第3天时gyrA基因第567、599位的碱基由C变为T、第513位的碱基由T变为G；对照菌株仅在培养第2天时有1株菌gyrA基因第521位的碱基由T变为C，另1株菌gyrA基因第599位的碱基由C变为T。以上碱基突变并未引发氨基酸突变，为沉默突变。携带PMQR基因且QRDR未突变的菌株，经恩诺沙星诱导后parC基因未发生突变。不携带PMQR基因且QRDR未突变的菌株，在恩诺沙星诱导后未发生任何突变。

3 讨论与结论

自1960年以来，在临床上由大肠杆菌引起的疾病多使用FQs治疗[13]，该类抗生素主要通过抑制细菌DNA旋转酶和拓扑异构酶-IV的活性而抑制细菌DNA合成，从而发挥抑菌作用[14]。研究表明，随着FQs的大量使用甚至滥用，多数病原体对FQs的敏感性逐渐降低[15-17]，导致临床治疗面临极大的挑战。本试验从腹泻犊牛粪便中分离得到75株大肠杆菌，其中60.00%(45/75)的菌株至少耐2种FQs，40.00%的菌株对ENR、CIP、NOR均耐药，其中对ENR的耐药程度较为严重(60.00%)，这可能与ENR作为动物专用药在养殖场使用较为频繁有关。

QRDR突变是大肠杆菌耐FQs的主要原因，其主要通过抑制FQs与细菌DNA和酶复合物的结合，导致细菌耐药。gyrA基因编码的氨基酸突变位点通常为第67～106位[18-19]，parC基因编码的氨基酸突变位点通常发生于第71～110位[20]。研究表明，gyrA基因编码的第83、87位以及parC基因编码的第80、84位氨基酸的突变与FQs耐药密切相关[21-22]。本研究结果显示，牛源大肠杆菌有58.67%(44/75)发生了QRDR的突变，其中95.45%(42/44)的菌株同时发生了GyrA和ParC氨基酸突变。赵凤菊等[23]研究表明，动物源大肠杆菌GyrA氨基酸突变主要为Ile87Val、Leu101Met，ParC氨基酸突变主要为Ser80Ile；曹立亭等[24]研究表明，养殖环境中大肠杆菌的GyrA突变以Ser83Leu、Asp87Asn最常见。Nishikawa等[25]研究表明，日本鸡源大肠杆菌GyrA突变以Ser83Leu、Asp87Asn为主，ParC以Ser80Ile最盛行。综上可知，QRDR突变多出现在GyrA、ParC的氨基酸上，且以GyrA第83、87位及ParC第80位居多，与本试验结果一致。

虽然PMQR基因仅导致大肠杆菌对FQs低水平耐药，但由于其通过质粒介导，可以在不同菌株甚至不同种属间水平转移[13]，这对人类和动物的健康来说都是一个不可忽视的隐患。本研究结果表明，61.33%的大肠杆菌至少携带1个PMQR基因，其中qnrS和aac(6′)-Ib-cr基因最常见；并且存在多个PMQR基因共存于同一分离株中的现象，这在很大程度上提高了大肠杆菌对FQs的抗性，这与Wu等[2]及Mitra等[18]的研究结果一致。此外，QRDR突变与PMQR基因共存菌株比仅有QRDR突变菌株对FQs的耐药性更强，QRDR突变与qnrS+aac(6′)-Ib-cr共存的菌株比单独携带qnrS或aac(6′)-Ib-cr的菌株MIC更高，这与Piekarska等[26]的报道一致。

gyrA、parC是QRDR最容易发生突变的2个基因，已有研究表明含PMQR基因的接合子在CIP诱导后会出现GyrA蛋白第83、87位氨基酸突变[16]。本研究通过ENR诱导试验发现，PMQR阳性菌的gyrA基因出现5处碱基突变，且皆为沉默突变，未出现相应氨基酸的突变，表明在低剂量ENR存在的情况下，PMQR基因的存在一定程度上会影响gyrA基因序列的稳定性。PMQR阴性菌未发生突变。

以上结果表明，QRDR突变是大肠杆菌耐FQs的主要原因，PMQR基因仅赋予其低FQs抗性，但QRDR突变与PMQR基因共存一定程度上会加重耐药菌的耐药程度；此外，PMQR基因会增加gyrA基因序列的突变机率，尤其是ENR存在的情况下。因此临床上合理使用该类药物就显得十分必要，一旦造成致病性大肠杆菌发生QRDR突变，将可能导致该类药物治疗无效。