草果挥发油及其包合物GC-MS 成分分析及抑菌试验研究

刘 娜 丁 雄 赵 毅 苏刘艳 赵蓉羽

云南中医药大学中药学院，云南昆明 650500

草果（Amomum tsaoko），是姜科豆蔻属植物的果实，香味浓郁，具有燥湿健脾，除痰截疟的功效。主治脘腹胀满，反胃呕吐，食积疟疾等症[1-3]。挥发油是草果主要活性成分之一[4]，但易挥发、易氧化、不稳定、水溶性差等缺点，限制了其在医药方面的应用[5]。本研究用β-环糊精（β-CD）将其制成包合物，增加稳定性，提高利用度[6]，掩盖挥发油的异味[7-8]。本研究对草果挥发油及其包合物进行气相色谱-质谱（GC-MS）成分分析，同时，进行相关抑菌活性研究，以期为草果的综合开发利用提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

电子天平CP114（精密度0.1 mg，奥豪斯仪器上海有限公司）；SG8200HPT 型超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）；SHZ-CBZ 型循环水式多用真空泵（巩义市予华仪器有限公司）；低温冷却液循环泵DLSB-20L/30（巩义市予华仪器有限责任公司）；101-4AS 电热鼓风干燥箱（北京市永光明医疗仪器厂）；FA2104 分析天平（精密度0.1 mg，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；HP6890GC/5973MS 气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent Technologies 公司）。

1.2 试药

草果[产地：怒江州，经云南中医药大学杨雅竹副教授鉴定为姜科植物草果（Amomum tsaoko）的干燥果实]。正己烷（分析纯，广东光华科技股份有限公司，20181221）。氟康唑分散片（南昌弘益药业有限公司，181001）；DMSO（BioFRoxx，EZ2921C395）；沙氏液体培养基（广东环凯微生物科技有限公司，1076161）；沙氏固体培养基（广东环凯微生物科技有限公司，1076641）；亚甲蓝M-H 琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司，1081661）；LB 固体培养基（Solarbio，20190529）；琼脂（Agar，BioFRoxx，EZ1609C222）；氯化钠（分析纯，天津风船化学试剂科技有限公司，20181203）。

1.3 培养基和菌株

①试药：抗真菌活性检测阳性对照药物氟康唑溶于DMSO，离心取上清液，贮存浓度为50 mg/mL，4℃密封避光保存。②培养基：沙氏液体培养基、沙氏固体培养基、亚甲蓝M-H 琼脂培养基、LB 液体培养基、LB固体培养基。③菌株：白色念珠菌标准株SC5314、白色念珠菌临床分离耐药株23#（昆明医科大学第一附属医院李玉叶惠赠）、金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922。

2 方法与结果

2.1 草果挥发油的制备

采用水蒸气蒸馏法提取草果挥发油[9-10]。精密量取挥发油0.5 mL，至10 mL 量瓶，加正己烷，定容至刻度，混匀，过0.45 μm 微孔滤膜，进行GC-MS分析。

2.2 草果挥发油包合物的制备

β-CD 为包合材料[11]，超声法制备挥发油包合物。精密称取包合物3 g 加100 mL 水超声破坏30 min。置于圆底烧瓶中重提挥发油，精密量取挥发油0.5 mL，至10 mL 量瓶，加正己烷，定容至刻度，混匀，过0.45 μm 微孔滤膜，进行GC-MS 分析。

2.3 GC-MS 条件与结果

2.3.1 GC-MS 条件

2.3.1.1 GC 条件HP-5MS 石英毛细管柱（30 m×0.25mm×0.25 mm）；柱温：起始温度40℃，程序以3℃/min 升温至80℃，再以5℃/min 升温至280℃，保持5 min；柱流量为1.0 mL/min；进样口温度250℃；柱前压100 kPa；进样量1.0 mL；分流比10∶1；载气为高纯氦气。

2.3.1.2 MS 条件 电离方式EI；电子能量70；传输线温度250℃；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；质量范围35～500；采用wiley7n.l 标准谱库计算机检索定性。

2.3.2 GC-MS 成分分析结果

参考文献[12-14]对草果挥发油及其包合物进行GCMS 测试，2 种挥发油的总离子流（TIC）如图1、2 所示。对2 种挥发油的GC-MS 成分分析，见表1。将各组分质谱数据由wiley7n.l 标准谱库检索并结合有关参考文献[15-17]等，鉴定了60 个化合物，用峰面积归一化法计算各成分在挥发油的相对百分含量。见表1。

草果挥发油分离出68 个化合物，鉴定68 个；草果包合物挥发油分离出64 个化合物，鉴定60 个。其中共有含量较高的主要成分有13 个序号分别为：14、10、40、44、4、6、54、30、37、42、47、63、51（按化合物占草果挥发油总化合物的含量从高到低排序），以上13 个化合物占总化合物比例分别为：占草果挥发油的81.03%；占草果包合物挥发油的79.89%。

草果挥发油包合前后60 个化合物未发生改变，分别占草果挥发油总化合物的99.11%，占草果包合物挥发油总化合物的99.65%。数据显示挥发油经超声包合处理后，99%以上的成分都包合进入β-CD中，形成稳定的包合物。

图1 草果挥发油总离子流图

图2 草果包合物挥发油总离子流图

挥发油中有8 个化合物经包合后CG-MS 未检出序号分别是1、9、13、28、34、49、65、67，以上8 个化合物在草果挥发油中占总化合物的0.89%；草果包合物挥发油中有4 个成分占总化合物的0.35%，在原挥发油中未检出，也未鉴定出。本研究推测原油中的8 个化合物可能在超声作用下不稳定（如顺式结构）转化成其他更加稳定的结构[18]，或者是分子结构过大，没有被包合。包合后的挥发油中未鉴定出的4 个化合物，有可能是原油中的化合物在超声作用下发生结构转化而产生的，本课题组将进行后续的相关研究。

2.4 抑菌试验实验方法与结果

2.4.1 抑菌试验实验方法K-B 法（标准滤纸片法）

①取纯菌落，制备菌悬液，调整浓度为1×107CFU/mL，每个平板各加载菌液500 μL，立即用棉拭子均匀涂板，放置10 min 左右，待菌液完全吸收，用镊子加载直径为6 mm 的无菌滤纸片。②加载纸片后，取一定量的待测样品（样品为挥发油、和包合物重蒸后挥发油，均为液体状）加载在滤纸片的正中心，防止抑菌圈畸形，待样品均匀、完全的吸收后，放入恒温恒湿箱中，孵育24 h 后，测量抑菌环的直径。③在不反光的黑色背景下读取抑菌圈的直径，抑菌圈的直径包括纸片的直径。

2.4.2 挥发油抑菌活性实验结果

针对草果具有燥湿健脾，除痰截疟的功效，参考文献资料[19-21]，本研究选择了4 种菌种进行抑菌活性实验，结果见表2：草果挥发油及其包合物对白色念珠菌标准株和耐药株抑菌圈的直径都已经超过整个培养皿（>40 mm），整个培养皿不长菌，有很好的抑菌效果，并且抑菌效果明显优于氟康唑。对金黄色葡萄球菌抑菌效果较好；对大肠埃希菌有一定的抑菌效果。综上所述，草果挥发油及其包合物对4 种菌种均有抑制作用，且包合前后的抑菌效果没有显著性的差异。

3 讨论

采用水蒸气蒸馏法[22]提取草果挥发油，β-CD 作为包合材料[23]，超声法进行草果挥发油的包合，通过GC-MS 成分分析，挥发油99%以上的成分都包合进入β-CD 中，形成稳定的包合物。同时，包合前后的抑菌效果没有显著性的差异，再次佐证了包合物对挥发油成分进行物理包合，工艺稳定。本研究对β-CD 包合理论[24]提供实验数据支持。草果挥发油及其包合物对白色念珠菌标准株以及耐药株都很好的抑菌效果，可为云南省草果产业的发展[25]提供科学依据。

表1 草果挥发油和包合物的GC-MS 成分分析表

表2 草果挥发油和挥发油包合物抑菌活性实验汇总表（mm）