星点设计-效应面法优选小儿益肺健脾煎膏剂提取工艺研究

韦艳萍 谭栀恩 陀海燕 曾佩琴 刘雅婷 覃柳馨 易 蔚 陈卫卫,2,3

1.广西中医药大学药学院，广西南宁 530001；2.广西中药制剂共性技术研发重点实验室，广西南宁 530001；3.广西壮瑶药重点实验室，广西南宁 530001

小儿益肺健脾煎膏剂出自广西中医药大学第一附属医院临床经验方，具有健脾益气、消食化积、调和营卫、敛汗生津的功效，主要用于治疗小儿肺脾气虚、免疫力低下、自汗、腹胀厌食、便溏等病症，效果良好。该方由陈皮、太子参、白术、山药、莲子肉、桂枝、炒山楂、炒鸡内金、炒麦芽、桔梗、浮小麦等组成，临床以汤剂入药，存在临用需煎煮、服用剂量大、患者顺应性差、易霉变、携带储存不便等缺点，为使其携带、服用方便且能达到较高的利用率，将汤剂改为煎膏剂。煎膏剂有效物质浸出量较多，利用率高，可服用较长时间，吸收快，服用方便，较易贮存，益于滋补，适用于慢性病和久病体虚者。陈皮、太子参、白术为君药，具有平补脾胃之气、健脾益肺的功效[1-4]；臣药以山药、莲子肉助君药健脾益气，辅白术以健脾渗湿，桂枝温养脾胃、调和营卫；佐以炒山楂、炒鸡内金、炒麦芽消食化积，使上下气机贯通则脾胃运化健旺，腹胀厌食可除；桔梗宣肺利气、载药上行、培土生金，浮小麦固涩敛汗，共为佐使之用。君药陈皮中的橙皮苷能够增强机体免疫功能[1-3]。现代药理研究[5-7]显示，太子参中苷类及多糖类等成分能够提高机体免疫功能，白术多糖与白术挥发油均有一定的免疫调节作用[8-11]。以中医药理论为指导，运用现代制剂技术，对处方药材有效成分提取精制，制成小儿益肺健脾煎膏剂，够调节身体机能，起到健脾益气的效果，提高小儿免疫力，满足小儿健康成长需求，具有广阔的开发空间和潜在的市场前景，值得深入研究与开发。

结合工业化大生产特点及实际科研情况，将橙皮苷含量和干膏率的总评“归一值”（OD）值作为评价指标，按照单因素试验和二因素五水平星点设计进行提取工艺实验优选小儿益肺健脾煎膏剂提取工艺，为该制剂的后续研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（Waters 2695，美国Waters 科技有限公司）；电热鼓风干燥箱（GZX-9420MBE，上海博讯实业有限公司医疗设备）；Thermo 离心机（TGL-16G，赛默飞世尔科技公司）；电子天平（JM-A5002，诸暨市超泽衡器设备有限公司）；超纯水器（UPC-II-10T，四川优普超纯科技有限公司）；电热恒温水浴锅（HWS-12，上海齐欣科学仪器有限公司）；电子调温电热套（98-1-B，天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试药

橙皮苷对照品（中国食品药品检定研究所，批号：110721-201617）；甲醇（色谱纯，美国Fisher 公司，批号：178500）；乙腈（色谱纯，美国Fisher 公司，批号：175165）；磷酸（分析纯，成都金山化学试剂有限公司；批号：20161202）；水为超纯水；药材购自广西仙茱中药科技有限公司，由广西中医药大学宁小清高级实验师鉴定，均符合《中华人民共和国药典》[12]2015 年版一部要求。

2 方法与结果

2.1 测定橙皮苷含量

2.1.1 色谱条件

采用反相色谱柱Inertsil ODS-3 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），甲醇（A）-乙腈（B）-0.1%磷酸溶液（C）作为流动相，梯度洗脱0～30 min（A：10%～30%，B：10%～30%，C：10%～40%），流速为1 mL/min，检测波长为283 nm，柱温为35℃，进样量为10 μL。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称定适量橙皮苷对照品，加80%甲醇制成含0.80 mg/mL 的橙皮苷对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

称取处方量药材，加入9 倍水，煎煮法提取2 次，每次1 h，滤过，合并滤液，定容。取适量溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.4 阴性干扰溶液的制备

称取除陈皮外的所有药材，按“2.1.3”项下方法制备阴性干扰溶液。

2.1.5 测定法

分别取对照品溶液、供试品溶液及阴性干扰溶液，进样量为10 μL，按照“2.1.1”项下色谱条件进样测定。见图1。

图1 高效液相色谱图

2.1.6 方法学考察

2.1.6.1 精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液8、10、12、14、16、18 μL，按“2.1.1”项下色谱条件测定。以对照品进样量（μg）为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y），得回归方程Y=1277.527 88 X+7.284 272 9（r=0.99996），结果表明橙皮苷进样量在0.8000～1.8000 μg 范围内呈良好的线性关系。见图2。

图2 橙皮苷标准曲线图

2.1.6.2 精密度试验 按“2.1.1”项下色谱条件，精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液，重复进样6 次，测定峰面积，RSD 为1.37%，表明仪器的精密度良好。见表1。

表1 精密度试验（n=6）

2.1.6.3 重复性试验 称取同一批药材6 份，按“2.1.3”项下制备样品溶液，测定橙皮苷峰面积，RSD 为1.24%，表明测定方法的重复性良好。见表2。

表2 重复性试验结果（n=6）

2.1.6.4 稳定性试验 取“2.1.3”项下供试品溶液，在0、4、12、24、36、48 h 进样，测定橙皮苷峰面积，RSD 为1.86%，表明供试品溶液在48 h 内稳定。见表3。

表3 稳定性试验结果（n=6）

2.1.6.5 回收率试验 精密称定同一批药材9 份，按样品中成分80%、100%、120%的比例加入对照品各3 份，按“2.1.3”项下供试品溶液，测定橙皮苷含量，平均回收率分别为97.02%、97.58%、98.18%，RSD 分别为2.09%、1.86%、1.83%。加样回收率（%）=（测得量-原有量）/加入量×100%。见表4。

表4 加样回结果（n=9）

2.1.7 样品含量测定

精密称取3 批药材，按“2.1.3”项下制备供试品溶液，测定峰面积，计算得出橙皮苷的平均含量为321.432 mg/g，RSD 值为1.88%。见表5。

表5 含量测定结果（n=3）

2.2 干膏率的测定

精密吸取定容后的供试品溶液20 mL，置恒重蒸发皿，水浴蒸干后，105℃下干燥5 h，置干燥器冷却至室温，迅速精密称定，干燥1 h，至连续两次重量差异≤5 mg，计算干膏率（%）[13-14]。干膏率=（干膏重量/取样体积）×（药液体积/药材重量）×100%。

2.3 药材吸水率的考察

称取同批药材6 份，加10 倍量水浸泡0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 滤净水称重[15]，吸水率%=（湿药材重量-干药材总重量）/干药材总重量×100%。见表6。

表6 吸水率考察结果（%，n=6）

3 单因素试验与结果

基于原方提取工艺、成本考虑，选择水提取。综合考虑能源损耗、后续放大生产的合理性、提取次数的非连续性，提取两次。综合预实验结果及文献报导对橙皮苷含量、干膏率测定影响较大的加水倍数和提取时间[16-18]两个因素水平的合理取值范围进行考察。

3.1 提取时间的考察

称取药材7 份，分别加10 倍量水，煎煮两次，每次60、90、120、150、180、210、240 min，滤过，合并滤液，定容，离心，经0.22 μm 微孔滤膜滤过。按“2.1.1”项下色谱条件与“2.2”项下方法测定橙皮苷含量和干膏率。由表7 可知，橙皮苷含量和干膏率随提取时间增加而增加，240 min 时橙皮苷含量略有下降，干膏率无明显变化。故提取时间范围选为90～240 min。

表7 提取时间考察结果

3.2 加水倍数的考察

称取7 份药材，分别加入6、9、12、15、18、21、24 倍水，煎煮2 次，每次1 h，滤过，合并滤液，定容，离心，微孔滤膜过滤，按“2.1.1”项下色谱条件与“2.2”项下方法测定橙皮苷含量和干膏率。由表8 可知，橙皮苷含量和干膏率均随加水倍数增大而升高，加水倍数为21 倍时，干膏率不再明显增加，故加水倍数范围为9～24 倍。

表8 加水倍数考察结果

4 提取工艺优选

4.1 试验设计

基于单因素试验结果及实际生产经验，提取2 次，将加水倍数、提取时间作为考察因素，按星点设计原理，进行二因素五水平试验。见表9。

表9 因素与水平表

4.2 星点设计实验安排及结果

采用Hassan 方法标准化的将本实验评价指标（橙皮苷含量和干膏率）取值越大越好分别转化为0～1 间的OD 值，按OD=（d1×d2…dk）1/k（k 为指标数），转换公式为di=（yi-ymin）/（ymax-ymin）[19-20]。见表10。

表10 星点设计实验安排及结果

4.3 模拟拟合

应用Design-Expert 8.0.6 进行数据分析，以OD 值对两因素进行多元线性回归，多元拟合方程为Y=-1.138 35+0.049 458X1+5.481 28×10-3X2（r=0.8823，P ＜0.01），表明OD 值与两个影响因素之间线性相关较差，回归拟合度不佳，预测性不好，该模型不合适，故采用多元二次项拟合分析。二次项拟合方程为Y=-3.374 60+0.186 70X1+0.020 304X2-1.78142×10-4X1X2-3.268 25×10-3X12-3.600 96×10-5X22（r ＝0.9724，P ＜0.01）。表明非线性r 值较高，拟合效果较好。

4.4 方差分析

采用SPSS 18.0 统计学软件进行数据分析，由表11 可知，多元二次项回归方程失拟检验无显著性，未知因素对试验结果影响很小。模型具有高度显著性，该方程与实际情况拟合较好，很好地反映了此模型的可靠性。除X1X2回归系数不显著外，其他均达到显著水平。

4.4 效应面优化和预测

采用Design-Expert 8.0.6 软件，得到三维效应曲面图和等高线图，由图3～4可知加21 倍量水、提取212 min 时，预测总评OD 值为1.001 61。结合实验操作及实际工业大生产情况，最佳工艺条件确定为加21 倍量水，提取2 次，每次212 min。

表11 方差分析结果

图3 加水倍数和提取时间对总评OD 影响的三维效应面图

图4 加水倍数和提取时间对总评OD 影响的二维等高图

4.5 验证试验

依上述最优工艺进行实验。实测OD 值为0.836 30，较方程预测值，偏差率[21，23]为-16.531%。表明所建立的数学模型具有良好的预测性，所选工艺条件稳定性、重现性好。见表12。

5 讨论

参考《中华人民共和国药典》[12]2015 年版陈皮药材含量测定方法，考察流动相（甲醇-0.1%磷酸，乙腈-0.1%磷酸）全梯度洗脱，结果甲醇-0.1%磷酸分离时间较长，乙腈-0.1%磷酸分离度不稳定，优化甲醇-乙腈-0.1%磷酸，橙皮苷含量测定分离效果好。考察不同柱温（25℃、30℃、35℃）的分离效果，35℃时，分离时间较快、效果好。

研究表明[5-7]，太子参有效成分多糖能增强免疫功能，但含量较低且测定方法繁琐，可操作性差。白术有效成分白术内酯Ⅰ具有健脾作用[24-25]，但其含量较低及原料含量差异大，品质难以把控，故不考虑作为检测指标。君药陈皮有效成分橙皮苷能够调节免疫功能，从而起到健脾作用[1-3]，故将君药陈皮中橙皮苷含量作为检测指标，太子参与白术作为定性检测，把控制剂质量。

正交设计法、均匀设计法作为国内比较成熟的试验设计优化方法，简单易行，结果易得，但精度不够。星点设计-效应面法更全面，试验次数较少，试验精度高，并适用于多因素、多水平试验、数据处理简便。试验结果由软件直接读出，并进行预测，减少主观因素的影响[26-27]。因此，本实验采用星点设计-效应面法优化小儿健脾益肺煎膏剂提取工艺，实际值与预测值偏差在合理范围内，表明此方法预测效果良好、可靠。

表12 验证试验结果