定点突变鉴定Myxococcus sp.V11麦芽糖基海藻糖水解酶MTHase的催化中心

陈允妲，李雪亮，吴映函，赵晓艳，吴晓玉，王 飞*，陈金印

（1.江西省农业微生物资源开发与利用工程实验室，江西农业大学 生物科学与工程学院，江西 南昌 330045；2.江西省果蔬保鲜与质量安全创新中心，江西 南昌 330045）

【研究意义】海藻糖（Trehalose），又名蕈糖，是由2 个吡喃环葡萄糖分子以a，a-1，1 键连接而成的双糖，化学名为a-D-吡喃葡糖基a-D-吡喃葡糖苷[1-2]。海藻糖作为一种天然糖类，它在自然界的动植物和微生物中广泛存在，对生物有抗脱水、抗冷冻保护和抗高渗保护等多种作用。【前人研究进展】利用淀粉为底物直接生产海藻糖涉及2种酶，麦芽寡糖基海藻糖合成酶（maltooligosyltrehalose synthase，MTSase，由TreY 基因编码）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（maltooligosyltrehalose trehalohydrolase，MTHase，由TreZ 基因编码）[3]，作用途径（TreY-TreZ）如下：麦芽寡糖在MTSase作用下通过转糖苷作用，将起始的2个葡萄糖之间的a，a-1，4 键扭转成为a，a-1，1 键，形成麦芽寡糖基海藻糖，继而在MTHase 水解作用下，将起始的海藻糖从麦芽寡糖基上水解下来，形成麦芽寡糖（比初始底物少2 个葡萄糖基）和1 分子的海藻糖[4]。α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）是一种水解淀粉α-1，4-葡萄糖苷键，生成低聚麦芽糖和葡萄糖的糖苷水解酶类，在食品发酵、制药等领域广泛利用。在根据蛋白质的序列同源性分类的CAZy数据库中，GH13家族被认为是最主要的α-淀粉酶家族，具有4-7个保守的序列区，包括了Asp-Glu-Asp 的催化三联体和重要的底物结合位点[5]，而这些特征在MTHase中也同时具有[6]。【本研究切入点】实验室分离筛选到的一株粘细菌Myxo⁃coccussp.V11在子实体形成阶段，细胞内可积累10倍于营养细胞阶段的海藻糖，通过基因组扫描发现存在着一个TreY-TreZ 合成途径，分别由orf6342 和orf3024 编码，将orf3024（TreZ，mthase）异源表达后发现不能以麦芽寡糖基海藻糖水解为底物，而是具有淀粉水解活性。【拟解决的关键问题】本文通过对推测的几个活性中心位点进行突变，来考察其功能。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株：E.coliDH5α（pET-29a-mthase）克隆菌株（含麦芽糖基海藻糖水解酶mthase基因），E.coliBL21（pET-29a-mthase）表达菌株，克隆菌株E.coliDH5α，表达宿主菌株E.coliBL21（DE3）均为本实验室保藏。

CaCl2，NaOH，Tris，HCl，EDTA，SDS，胰蛋白胨，酵母提取物，NaCl，均购于国药集团化学试剂有限公司。琼脂糖凝胶、考马斯亮蓝G250，牛血清蛋白，卡那霉素（Km）购于上海生工。质粒提取试剂盒，凝胶回收试剂盒购自Solarbio 公司；定点突变试剂盒购自TransGen Biotech 公司；质粒提取回收试剂盒购自北京派泰克生物技术有限公司。引物合成及核酸测序委托湖南擎科生物科技有限公司。

LB培养基（g/L）：酵母粉5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0，pH 7.0～7.2。

1.2 仪器

PCR 扩增仪（Biometre T1）、Beckman台式高速冷冻离心机（Allegra X-22R）、DYCP-31DN水平核酸电泳仪、Bio-rad Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳仪等。

1.3 引物

定点突变引物序列见表1。

表1 MTHase定点突变PCR扩增所用引物Tab.1 Primers used for PCR amplification of MTHase directed mutation

1.4 氨基酸序列分析及突变位点的选择

将菌株V11 所产MTHase 氨基酸序列提交至NCBI 数据库，与已报道的MTHase 进行比对，下载相似度高的序列。利用MEGA 6.0软件构建系统发育树，BioEdit 7.0进行序列比对，分析保守氨基酸序列和活性中心氨基酸残基。以Swiss-Model进行三维结构在线建模。

1.5 PCR介导的定点突变

以提取的质粒为模板，进行重叠延伸PCR 扩增，PCR 体系为2× TransStart FastPfu PCR SuperMix 12.5µL，正向引物1.0µL，反向引物1.0µL，质粒DNA 1.0µL，ddH2O 9.5µL。

PCR 程序为95 ℃预变性2～5 min，95 ℃变性，55 ℃退火，72 ℃10 min，30 个循环，然后用0.75%琼脂糖凝胶电泳检测。

RCR 产物经DMT 酶（改良型的DpnI 限制性核酸内切酶）消化非突变型质粒模板后，转化至E.coliDH5α感受态细胞[7-9]。阳性克隆经电泳检测，大小无误后，送样品至祥音生物科技有限公司测序，测序正确的质粒转化至E.coliBL21（DE3）感受态细胞，构建突变表达菌株。

1.6 重组酶表达纯化

野生型和突变型的表达菌株接种至400 mL LB液体培养基（含有80 mg/L Kan），37 ℃，180 r/min培养至OD600约为0.6时，加入80µL 0.5 mmol/L IPTG，16 ℃诱导24 h。

将培养好的菌液12 000 r/min 离心5 min 收集菌体，用20 mL Tris-HCl 缓冲液（pH7.0，20 mmol/L）重悬洗涤菌体。12 000 r/min 离心5 min 后再以10 mL Tris-HCl 缓冲液重悬，超声破碎。12 000 r/min 4 ℃离心15 min，上清即为粗酶液。Ni2+-NTA 亲和层析柱预处理后将粗酶液上样，冰浴30 min。20 mL Tris-HCl 缓冲液（pH7.0，20 mmol/L）穿过，以含200 mmol/L 咪唑的20 mL Tris-HCl 缓冲液（pH7.0，20 mmol/L）洗脱，SDS-PAGE 电泳检测表达情况[10]。洗脱液在4 ℃下以截留分子量10 ku 的透析袋在20 mmol/L Tris-HCl（pH7.0）缓冲液中透析过夜去除咪唑。蛋白含量测定采用Bradford法[11]。

1.7 酶活测定方法

在含有底物玉米淀粉（0.03%，m/v）的Tris-HCl 缓冲液（20 mmol/L，pH6.5）中加入适量纯酶，40 ℃水浴反应3 h，用DNS 法测量，计算酶活。比较野生型（WT）和突变型（D256A，E291A，D386A 的单位酶活力）。酶活力定义：在40 ℃反应体系下，每分钟催化生成1µmoL 麦芽糖所需要的蛋白质含量（mg）1个酶活力单位。

2 结果与分析

2.1 MTHase的突变位点的选择

将菌株V11 所产MTHase 氨基酸序列提交至NCBI 数据库，与已报道的MTHase 进行比对，下载相似度高的序列，利用MEGA 6.0软件，邻接法构建系统进化树，结果见图1。

图1 Myxococcus sp.V11 MTHase系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of MTHaseof Myxococcus sp.V11

系统进化树结果表明Myxococcussp.V11 所产MTHase 与已报道的Deinococcus radiodurans所产麦芽寡糖基海藻糖水解酶（Maltooligosyltrehalose Trehalohydrolase，DR0464）相似度最高，但仅为49.23%，与已报道的淀粉酶相似度则有较大差异。

将Myxococcussp.V11 所产MTHase 与已解析的麦芽寡糖基海藻糖水解酶：来源于Deinococcus radio⁃durans（2BHU）[12]，来源于Saccharolobus solfataricus（1EH9）[13]，来源于Salmonella enterica（3M07）[13]氨基酸序列进行比较，结果见图2。麦芽寡糖基海藻糖水解酶具有几个严格保守的区域：GTFTPEG、WGYDG、ED、GLXVXLDXVXNHXGPXGNY、DGXRXDA、IQNHDQ。三联体活性中心（Asp256-Glu291-Asp386）[14]均位于保守区域之内。因此，拟将活性中心的3个氨基酸统一突变成没有侧链的Ala，通过观测其催化活性的变化来进行验证。

图2 MTHase与其它TreZ氨基酸序列的比较Fig.2 Comparison of amino acid sequences of different Maltooligosyltrehalose Trehalohydrolases

2.2 MTHase基因的定点突变

以表达载体pET-29a-mthase为模板，按表1 所设计的D256A、E291A、D386A 引物，按定点突变试剂盒说明进行PCR 扩增突变质粒，重叠延伸PCR 产物凝胶回收后与DMT 在37 ℃下孵育1 h，热激转化至E.coliDH5α，阳性克隆培养后提取质粒。以pET29a 空载和pET29a-mthase（WT）为对照，0.75%琼脂糖凝胶电泳检测（图3）。重组质粒大小为7 kb 左右，其超螺旋大小位于5 kb 左右。将大小无误的质粒送至湖南擎科生物科技有限公司测序，测序正确的突变质粒热激转化至E.coliBL21（DE3），构建表达菌株。

图3 重组质粒电泳图Fig.3 Agarose gel electrophoresis of site-directed mutagenesis mthase by overlapping PCR.

2.3 重组酶的诱导表达和纯化

将野生型和突变型MTHase进行诱导表达，收集菌体后，超声波破碎，12 000 r/min离心20 min 后，上清液以Ni2+-NTA 进行纯化（图4）。

图4 突变型和野生型MTHase的SDS-PAGE凝胶电泳检测Fig.4 Analysis of the expression of the mutant enzymes on SDS-PAGE

SDS-PAGE 结果显示野生型海藻糖水解酶的蛋白质量约为68 ku，野生型WT和突变型D256A、D386A 都能够可溶性大量表达，但突变型E291A 表达量却非常低，并且也没有大量形成包涵体，这一氨基酸位点的改变对表达的影响机制尚不清楚。

2.4 突变酶的催化活性

对纯化所得重组酶洗脱液进行蛋白定量后，取1.11 mg重组酶，加入终浓度为0.03%底物淀粉后，在pH6.5、40 ℃水浴中反应3 h，以DNS 显色，测定酶活。结果显示突变型D256A、D386A 和E291A的活性均丧失，只有野生型能够测出酶活（图5）。

图5 野生型与突变体酶活对比Fig.5 Compared with activity of mutant recombinant MTHase and wild-type

2.5 MTHase同源建模

菌株Myxococcussp.V11 所产MTHase 与2BHU 相似度达49%，可以通过同源建模的方式来推测其三维结构。以2BHU为模板，在Swiss-Model进行三维结构预测，所得结果见图6。

MTHase 分子呈椭圆形，由3 个结构域组成（图6a），催化结构域Domain A（Ala95-Asp316，Gln372-Ser512）形成一个典型的（α/β）8桶状结构（图6b），这一结构是糖苷水解酶GH13家族的典型特征[15]。这一家族的糖苷酶包括α-淀粉酶、支链淀粉酶、环麦芽糊精酶、6-磷酸海藻糖水解酶、α-葡萄糖苷酶、海藻糖合酶、淀粉和蔗糖磷酸化酶等[16]。Domain A 的中间形成一个裂口，活性中心位于口袋之内；N 端结构域（Domain B）主要为β-折叠结构（图6b），Domain C 的差异性则被认为与底物特异性相关。催化三联体Asp256-Glu291-Asp386 位于靠近Domain C 的位置（图6c），其中Glu291 提供质子用于水解糖苷键，Asp256 为亲核试剂，Asp386 起着稳定构象的作用。图6c 显示MTHase 的Asp386（红色）与2BHU 的Asp400（蓝色）构象略有差异，这一改变是否对活性有影响尚待验证。

图6 MTHase的三维结构示意图Fig.6 3D structure of MTHase and 2BHU

3 结论与讨论

麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase和淀粉酶amylase同属于GH13糖苷酶家族，后者随机切割淀粉分子内部的α-1，4 糖苷键，前者则对存在于海藻糖分子之后的α-1，4 糖苷键有更强作用。通常情况下，MTHase 也具有淀粉水解功能，双功能催化中心可能共用，但有些糖苷酶如海藻糖合酶的活性中心由不同的结构域组成。

本文通过定点突变的方法对预测的菌株Myxococcussp.V11所产MTHase活性中心的3个氨基酸残基Asp256-Glu291-Asp386进行了验证，结果证实这3个位点氨基酸的改变直接导致淀粉酶活力的丧失，突变重组酶以底物海藻糖－麦芽糖基进行验证时，同样也没有测到酶活。表明MTHase的催化中心正是由Asp256-Glu291-Asp386所构成。

学术界普遍认为GH13 家族糖苷酶对不同底物的适应性主要与底物结合的氨基酸位点有关[17-21]，MTHase 与底物分子麦芽糖基海藻糖的第1 个葡萄糖苷连接的氨基酸分别为Gly197，Pro198，Gly200，Asn201，Tyr202，Trp210 均与2BHU 一致（图6d）；第2 个葡萄糖苷连接的氨基酸Asp316，Asp317，His320，Tyr337，Arg366，Asn390 也与2BHU 一致，唯一的区别是2BHU 里的Glu376 在MTHase 中被替换成了Leu362（图6e）；与第3个葡萄糖苷连接的氨基酸Trp219，Arg452，Glu455也与2BHU一致，不同的是2BHU里的Phe452 在MTHase 中被Tyr436 所替换（图6f）。导致MTHase 的活性表现为淀粉酶活性的原因是否由于Glu362Leu和Phe436Tyr所致尚待进一步研究。