利用CRISPR/Cas9技术创制香稻

唐秀英，龙起樟，王会民，朱雪晶，黄永兰，芦 明，万建林

（江西省超级水稻研究发展中心，江西 南昌 330200）

【研究意义】稻米是我国60%以上人口的主食，随着人们生活水平的不断提高，具有香味的优质稻米日渐受到消费者的欢迎。香稻是一种具有特殊香味的水稻，其在蒸煮、食用时清香飘逸，被誉为“粮中珍品”，如国际上的巴斯马蒂香米和泰国茉莉香米至今仍享有盛誉。香味性状是评价大米品质的重要指标，现已成为育种者选育优质稻米品种的目标之一。【前人研究进展】水稻的香味性状主要由第8染色体上的一对隐性基因控制，该基因含有15个外显子和14个内含子，编码甜菜醛脱氢酶（BADH2）[1]。研究发现，大多数香稻品种中，BADH2基因的第7外显子上有8 bp缺失和3 bp差异，或者第2外显子上有7 bp缺失，导致该基因翻译提前终止，编码的BADH2 结构发生改变，BADH2 的反应底物2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）积累而产生香味[2]。稻米香味性状除了受BADH2基因主导作用外，还易受到生长环境条件（产地气候、种植土壤性质、灌溉水种类等）和存储加工方式的影响，通过传统的咀嚼法或KOH 法等主要依赖人的感官进行鉴定，容易受到育种家的主观因素影响。因此，传统的香味鉴定方法费时费工、鉴定结果准确性差、效率低。分子标记辅助选择是一种有效的水稻育种手段。目前，众多研究人员通过水稻传统育种结合功能分子标记辅助选择成功选育出香稻[3-7]，育种效率较传统选育高，然而大多数研究主要围绕香味基因的第7 外显子和第2 外显子处的碱基变异设计分子标记，多态性仅有8 bp 或7 bp 差异，须通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定，操作过程繁琐不便于开展大量样本的标记检测。【本研究切入点】近年来，CRISPR/Cas9 基因编辑技术以其独特的优势迅速发展起来，该技术操作简单、成本低、效率高，已广泛应用于水稻基因编辑[8-12]。利用CRISPR/Cas9技术定向编辑水稻BADH2基因成功率高，大大缩短香稻的选育进程。邵高能等[13]通过CRISPR/Cas9技术对水稻中花11的BADH2基因进行定点编辑，结果发现，在T1代突变材料中，BADH2RNA 水平显著下调，籽粒中2-AP 含量显著增加；T2代香型植株与野生型相比除分蘖数和结实率外，其余各项指标无显著差异。祁永斌等[14]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对浙江主要推广的水稻品种嘉58和秀水134进行香味基因编辑，利用气相色谱质谱联用仪检测糙米米粉中2-AP含量，结果在T2代基因编辑株系的米粉中2-AP 含量较野生型呈极显著增加。【拟解决的关键问题】本研究利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术，以适应江西种植的粳稻台南11 为研究材料，对水稻中BADH2基因进行定点敲除，快速培育具有香味的水稻材料，为进一步选育适应我省种植的优质香味水稻品种提供理论技术和材料支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为粳稻台南11。所有转基因材料种植于江西省农业科学院广福转基因试验基地（南昌），常规田间种植及水肥管理。

1.2 载体构建

本试验采用的CRISPR/Cas9 载体为江西省超级水稻研究发展中心实验室自行构建，该载体以pCU‑bi1390 为基础[15]，含有水稻密码子优化后的Cas9基因[16]、sgRNA 主体框架[17]、CmR-ccdB表达盒、潮霉素抗性标记、水稻U6 启动子[18]等。利用CRISPR-P（http://cbi.hzau.edu.cn/crispr）[19-20]在线工具，设计用于敲除BADH2基因（RAP ID：Os08g0424500）的sgRNA 引导序列，靶点位于基因的第3 外显子正义链上（基因组ORF 位置：1432-1441，mRNA CDS 位置：281-300）。根据sgRNA 引导序列及载体构建要求，分别合成末端4 个碱基外，其余碱基反向互补的寡脱氧核糖核酸即sgU6-F（cttgACTAGAGACGCTTGATTGT）、sgU6-R（aaacACAATCAAGCGTCTCTAGT）。将2条寡脱氧核糖核酸链退火成双链寡核酸，通过酶切、连接和转化把所得的双链寡核酸连接到CRISPR/Cas9载体即pCUbi1390Cas9-U6（图1）。对单克隆进行测序，检测克隆的正确性及完整性。

图1 农杆菌转化双元载体pCUbi1390Cas9-U6 T-DNA结构Fig.1 Structure of the T-DNA of the binary vectors pCUbi1390Cas9-U6

1.3 水稻遗传转化

利用农杆菌转化法转化水稻愈伤组织，方法参考Toki等[21]，利用潮霉素快速检测法对T0代再生苗进行T-DNA 插入阳性检测[22]，采用CTAB 法[23]提取T0代转基因阳性植株苗期叶片DNA，用U6-F（CACCTTTTCCCTTTTTCTTCAGATA）和U6-R（TGGATAACTGGCCACATACCAT）组成的引物对对转化子中的BADH2基因的靶位点进行检测。

1.4 香味物质2-AP测定

利用GC/MSD 气相质谱联用仪检测香味物质[24]。采用固相微萃取（SPME）技术收集挥发物[25]。称取2 g糙米粉装入4 mL样品瓶中，置于SPME专用采样台上90 ℃预热30 min，然后用含有65µm PDMS/DVB萃取头（SPME；Supelco）的SPME 针头刺穿瓶垫，暴露出SPME 纤维头吸附顶部空间的挥发物，90 ℃持续收集30 min。收回纤维头后收回针头，立即在色谱进样口250 ℃、5 min 解吸附，不分流模式进样，进样口内置内径0.75 mm 玻璃衬管（SGE Ltd.）。色谱柱为HP-5MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 mm 厚涂层，Agilent），载气为99.999%氮气，流速1.2 mL/min。色谱升温程序为：40 ℃保留3 min，以20 ℃/min升温至230 ℃，230 ℃保留2 min。质谱条件为：连接线温度230 ℃，离子源温度230 ℃，能量70 eV，检测器150 ℃。

质谱定性分析采用全扫描模式（fullscan）收集信号，利用NIST 谱库查询及其与标样比较的方法确认HPL 挥发产物成分。定量分析采用选择离子检测（SIM）模式。选用质荷比（m/z）为69，83 和111 的离子碎片对2-乙酰-1-吡咯啉进行定量。

1.5 转化子农艺性状分析

对野生型和突变型T3代（去除转基因成分的纯合突变株）的株高、有效分蘖数、每穗总粒数、结实率和千粒质量等产量性状以及蛋白质含量、直链淀粉含量、整精米率、长宽比和垩白度等品质方面进行考察分析。

2 结果与分析

2.1 BADH2基因突变分析

本研究共获得33 个独立的T0代转基因植株，对每个转基因植株进行测序，结果发现有16 个独立转基因植株发生了突变，基因突变率为48%。对这16个独立转基因植株的PAM 附近处的碱基变异情况进行分析，共检测到4 种突变类型（图2），其中插入突变1 种，缺失突变3 种。对T0代衍生的T1代进行叶片潮霉素抗性筛选，获得去除转基因成分的T1代植株，对植株中BADH2靶位点进行测序，选取纯合突变植株，利用T3代进行后续试验。目前，4种突变类型均获得了纯合后代。

图2 BADH2基因突变类型Fig.2 Mutation types of BADH2

2.2 BADH2基因敲除对2-AP含量的影响

利用GC/MSD 气相质谱联用仪对糙米中的2-AP 进行检测。将色谱峰质谱图逐一与NIST 谱库进行比对，发现保留时间5.5 min 的组分为2-AP。分别对野生型及4 种纯合突变后代植株籽粒中的香味物质2-AP 进行分析，结果发现，与野生型相比，4 种突变材料中的2-AP 含量均显著提高（图3）。因此，BADH2基因的敲除会引起水稻籽粒中2-AP 的积累而产生香味。

图3 野生型及不同突变体中2-AP相对含量Fig.3 Relative content of 2-AP in wile type and mutants

2.3 BADH2基因敲除对水稻农艺性状的影响

为了检测BADH2基因敲除对水稻产量和品质的影响，分别对野生型和4 个BADH2基因突变体材料（T3代）的产量性状（表1）及大米品质（表2）进行了测定。在产量性状方面，与野生型相比，4 个突变体材料发生了如下变化：株高略微下降，其中，TA4 突变体材料的株高下降呈显著性差异（降幅达3.4%）；有效分蘖数均下降，降幅4.6%～11.7%（均值8.0%），4 个突变体材料与野生型相比均呈显著性差异；每穗总粒数和结实率在4 个突变体材料之间表现不一致，除TA2 外，其他突变体材料表现下降。千粒质量在野生型和突变体材料间无明显差异。通过计算，4 个突变体材料的理论产量较野生型减产1.9%～17.0%（均值8.7%）。综上，BADH2基因的敲除引起有效分蘖数的明显下降，也会引起每穗总粒数和结实率的轻度下降（除个别突变类型外），从而导致产量的下降。在大米品质方面，与野生型相比，4 个突变体材料发生了如下变化：蛋白质含量明显增加（增幅9.8%～16.4%，均值12.7%）；直链淀粉含量轻微下降（降幅2.3%～6.8%，均值4.8%）；整精米率和长宽比均显著增加，增幅分别为2.7%～8.0%（均值6.2%）和0.7%～3.1%（均值1.8%）；垩白度显著增加（增幅8.0%～16.5%，均值13.2%）。因此，BADH2基因的敲除可能有利于提高米质。

表1 BADH2基因敲除对株高及产量性状的影响Tab.1 Effects of BADH2 disruption on plant height and yield traits

表2 BADH2基因敲除对大米品质的影响Tab.2 Effects of BADH2 disruption on quality

3 结论与讨论

利用CRISPR/Cas9 技术成功对台南11 第8 染色体上的BADH2基因进行了定点突变，突变体材料中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉含量显著增加，其理论产量较野生型减少，但品质有所提高。这些突变体材料的获得，为进一步选育香稻品种提供理论技术和材料支撑，加快了培育香稻品种的进程。

近年来，随着人们生活水平的提高，我国水稻育种已由产量导向转入品质产量并重阶段，市场上的高档优质米价格高且供不应求，香味作为优质稻的性状之一，为育种者的选育目标，已受到普通百姓的热追，如美香占2号、象牙香占、稻花香等常规稻以及野香优系列杂交稻在米质品尝试验中成为佼佼者，并多次列为对照品种或组合。传统的香稻育种主要通过品种间杂交及对后代的筛选鉴定，所需时间长。目前，CRISPR/Cas9 技术已成功应用于包括水稻在内的多种作物，该技术操作简单、快速，对水稻的某些基因尤其是香味基因突变率高，且容易筛选出不含转基因成分的突变体材料，因此，用CRISPR/Cas9 技术创制含有香味的水稻材料，将大大缩短选育香稻品种的时间。

为了验证香味基因与产量和品质的关系，笔者对台南11 野生型及4 个稳定的不同突变类型材料的产量和品质进行了统计分析，结果显示，水稻香味基因的功能缺失均会导致突变体材料中产量（有效分蘖数、每穗总粒数、结实率）和品质（蛋白质含量、整精米率、垩白度、长宽比）较野生型出现显著性差异，这一结果与邵高能等[13]和孙慧宇等[26]的结果有差异。此外，在4个突变体材料之间产量和品质也表现出一定的差异，这可能与转基因技术过程中的组织培养有关。