小反刍兽疫病毒结构与功能的研究进展

郗珊珊，张玲艳，贾伟娟，何云江，王学理

(内蒙古民族大学 动物科技学院，内蒙古 通辽 028000)

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)又叫做“羊瘟”，是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一种具有严重危害的高度接触性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类疫病。1942年Gargadennec等在西非科特迪瓦的绵羊和山羊机体上发现了一种类似于牛瘟但又和牛瘟有一定差别的疾病，1962年Gilbertt等从绵羊细胞中首次分离出PPRV，1979年Gibbs等证实了PPRV为副黏病毒科麻疹病毒属的成员[1-2]。PPRV同属的成员还有牛瘟病毒(Rinderpest virus，RPV)、犬瘟热病毒(Canine distemper vieus，CDV)、海豹瘟病毒(Porpoise distemper virus，PDV)及麻疹病毒(Measles virus，MV)等。近年来，小反刍兽疫不断出现在阿拉伯半岛、中东、南亚等地，并表现出迅速蔓延的趋势。2007年，该病首次出现在我国西藏的阿里地区，不久后新疆、甘肃、内蒙古等地不断报道该病的发生[3-4]。PPRV的潜伏期为2～7 d，以高热、口腔黏膜糜烂、眼部分泌物增加、白细胞数量减少、腹泻和呼吸困难为特征。除了绵羊、山羊等动物可以被感染外，骆驼、水牛和野生反刍动物也可患病，牛和猪不表现相应的症候反应。动物在感染PPR后还可能出现巴氏杆菌、大肠埃希菌和支原体等微生物的混合感染。该病通常在出现发热症状后的4～6 d内迅速死亡，高发病率(可达100%)和高死亡率(可达90%)的发病特点给PPR的临床预防、诊断和治疗带来了严峻的挑战。在2030年前OIE和FAO已将控制和消除PPR作为一项优先处理事项[5-10]。

1 小反刍兽疫病原学

小反刍兽疫病毒全长15 948 bp，病毒粒子大多数呈圆形或椭圆形，直径为130～390 nm，有囊膜包裹；核衣壳呈螺旋对称，直径约为18 nm，螺距约为5～6 nm。病毒基因组为单股负链无节段RNA，从3′端到5′端的基因顺序为N-P-M-F-HN-L[11-12]，密码子CTG把HN和L基因分开，密码子CTT把N、P、M、F基因相互分开，在PPRV基因组中，只有F基因以AGGG开始，其余基因均以AGGA的序列开始[13]。N、P、M、F、HN、L这6个基因分别编码相应的六种结构蛋白和两种非结构蛋白，其中N蛋白(核衣壳蛋白)、P蛋白(磷蛋白)和L蛋白(大蛋白)为构成病毒蛋白的主要结构蛋白，M蛋白(基质蛋白)、F蛋白(融合蛋白)、HN蛋白(血凝素蛋白)辅助参与病毒蛋白的构成，另外C蛋白和V蛋白在副黏病毒科的所有病毒中均表现得较为保守，并与病毒在宿主体内的复制和致病性有一定的关系[14]。

PPRV只有一个血清型，可分为 4 个系，Ⅰ系主要分布在西非，Ⅱ系在尼日利亚、喀麦隆北部等地大量分布，Ⅲ系主要分布在非洲东部，Ⅳ系主要在中东和西亚地区流行[15-16]。Enchery等[17]研究发现来自一个谱系的毒株可以免受其他谱系毒株的攻击，并且不同的PPRV毒株之间存在一定的交叉保护。

2 基因组结构及功能

2.1 核衣壳蛋白基因组结构及功能

核衣壳蛋白(N蛋白)全长1 689 bp，编码525个氨基酸，含有1个开放阅读框(Open reading frame，ORF)[18]。N基因有一个poly(A)尾巴，并且在3′端和5′端分别有一个长度为53 bp和43 bp的非编码序列。N蛋白是小反刍兽疫病毒中的一个结构蛋白，在不分段的负链RNA病毒中尤为常见，它的作用是包裹病毒的核酸使之免受核糖核酸酶的影响，防止破坏其结构和功能。N蛋白虽不能诱导机体产生保护性免疫，但其含量最高，免疫原性最强，目前多用于小反刍兽疫病毒的诊断检测[19]。核衣壳蛋白可以与基质蛋白共同作用促进病毒的装配，使RNA基因组壳体化，参与P-L聚合酶复合物的形成。2019年，Zhu等[20]在研究中首次证实，N蛋白通过干扰素调节因子3(IRF 3)抑制Ⅰ型干扰素(IFN)的产生，并抑制各种病毒干扰素刺激基因(Interferon stimulated genes，ISGs)的表达，IRF 3是一种关键的转录因子，是参与先天免疫应答基因表达所必须的物质，在诱导Ⅰ型IFN合成中发挥重要作用，并且N蛋白与IRF 3相互作用能抑制TANK结合激酶1(TBK 1)和IRF 3之间的反应进而抑制IRF 3的磷酸化。另外，Ⅰ型IFN可通过诱导ISGs表达触发细胞抗病毒反应，所以Ⅰ型IFN和ISGs在对抗病毒防御方面都是至关重要的[21-22]。有科学家发现N蛋白与P蛋白是PPRV的两个新型IFN拮抗因子，可通过阻断JAK-STAT信号，破坏宿主的抗病毒免疫应答起到拮抗剂的作用，显著抑制IFN-β诱导ISRE及IFN-γ诱导的GAS启动子的活化，从而削弱下游各种干扰素刺激基因的上调，并防止STAT1核转位，此研究拓宽了对PPRV介导的免疫逃逸的了解，并为小反刍兽疫疫苗的研发提供了参考[23]。

2.2 磷蛋白基因组结构及功能

P基因可以翻译出一个结构蛋白(磷蛋白)和两个非结构蛋白(C蛋白和V蛋白)，其中磷蛋白(P蛋白)全长1 655 bp，编码506～509个氨基酸，分子质量为54.9 kD，等电点为4.71，含有三个ORF；C蛋白和V蛋白分别包含117和298个氨基酸。P蛋白在所有蛋白中变异程度最高，其中C末端与N末端相比较为保守[24]，虽然P蛋白的氨基末端序列保守性较差，但其在基因组的复制和转录中是保守的。翟军军等[25]通过RT-PCR方法对PPRV整个P基因进行了克隆，并预测了其三级结构，表明P蛋白是由位于中间的α-螺旋及两侧的N端和C端组成，同时还对P蛋白的同源性进行了分析，研究发现PPRV与MV、CDV、及RPV的P蛋白氨基酸同源性在45.9%～50.6%之间，核苷酸同源性为60.1%～66.6%。P蛋白可以与N蛋白-RNA模板复合物结合激活转录，可与N蛋白和L蛋白结合成分子伴侣，使N蛋白保持为可溶状态与病毒RNA结合并作为转录复合物中的辅助因子。另外，P蛋白还可与L蛋白结合形成RNA聚合酶，再与N蛋白-RNA模板共同作用形成核糖核蛋白复合体，共同参与病毒RNA的复制和转录，由此可见P蛋白是一种多功能蛋白，在PPRV中发挥着重要的作用[26-27]。

2.3 基质蛋白基因组结构及功能

基质蛋白(M蛋白)在小反刍兽疫病毒蛋白中是最保守的，全长1 466 bp，编码335个氨基酸，分子量为38.1 kD。M蛋白具有三个高度保守的ORF和多个起始密码子(AUG)及终止密码子(TAA)，在基因的3′端有一个非编码区，其保守性较差。M蛋白位于病毒囊膜的内部，维持着病毒粒子的形态，与N、HN和F蛋白的胞质尾端可以相互作用，对病毒具有很好的保护[28]。Wang等[29]对PPRV-N、M、HN、F这四种结构蛋白进行克隆，发现PPRV-cDNA序列可以在Vero细胞中表达，导致病毒样颗粒(Virus like particles，VLPs)的释放，且其释放效率与真正的病毒粒子相似，但是在没有M蛋白的情况下就不能导致VLPs的释放，因此证明了M蛋白是促进VLPs装配和释放的必需蛋白。释放出的VLPs的形态与真正的病毒颗粒相似，将其分别皮下注射到小鼠和山羊体内，均能诱导动物产生PPRV特异性抗体，注射的VLPs增加了病毒中和抗体的能力，同时也促进了淋巴细胞的增殖，可以作为检测和根除PPR的候选疫苗株[30]。Liu等[31]以PPRV Nigeria 75/1基质蛋白的mRNA翻译区为参考设计了三种不同的小干扰RNA(Small interfering RNAs，siRNA)(M59、M208、M407)，合成后转染到Vero-SLAM细胞中，并使细胞感染PPRV，在感染36 h后M59、M407这两种siRNA能有效地诱导细胞融合，表明siRNA介导的M蛋白改变了与病毒糖蛋白的作用关系，从而加剧了细胞融合，阻碍了病毒释放，并最终在体外抑制病毒的复制。

2.4 融合蛋白基因组结构及功能

PPRV的融合蛋白(F蛋白)一般包括2 410个核苷酸，编码546个氨基酸，分子量为59.3 kD，具有高度保守性。F蛋白是I型膜糖蛋白，是PPRV病毒囊膜表面的一种纤突，其中CG的含量较高，5′端有病毒的特异性序列。融合蛋白和血凝素蛋白是病毒囊膜表面的两种糖蛋白，均可诱发保护性免疫应答，在pH为7的情况下，F蛋白将促使细胞膜与病毒囊膜发生融合[32]，NH蛋白负责与靶细胞结合，当细胞受体与病毒发生结合后，才能使病毒进入宿主细胞[33-36]。Wang等[35]通过构建的pET30a/F原核表达载体进行了免疫转印实验，结果显示pET30a/F可被山羊抗PPRV Nigeria 75/1多克隆抗体识别，而不能被空载体pET30a(+)识别，说明F蛋白具有良好的免疫反应性，这种特殊的多克隆抗体为进一步研究PPRV早期感染的发病机制和PPRV-F蛋白的结构与功能特征提供了有价值的工具。PPRV-F蛋白在疫苗的研究中具有重要作用，其中Wang等[36]将PPRV-F基因插入到重组载体pSCA1中研制自杀DNA疫苗，通过免疫荧光和免疫转印技术鉴定重组质粒pSCA1/F的抗原性，发现宿主的抗原性强弱与血清中肿瘤坏死因子和干扰素等细胞因子的水平相互对应，同时PPRV-F可诱导小鼠淋巴细胞增殖和产生特异性中和抗体，经pSCA1/F接种的小鼠在首次免疫24 h后细胞IL-2(白介素2)和细胞IL-10水平升高，干扰素和肿瘤坏死因子也从该时开始升高随后逐渐降低，表明该疫苗可在小鼠体内成功诱导细胞免疫和体液免疫，但仅在小鼠模型中研究疫苗的效果是不够的，应该考虑在天然宿主例如绵羊和山羊体内进行深入的研究，这可作为一种新型PPR疫苗的研发方向。Rojas等[37]利用表达PPRV-F和PPRV-HN蛋白的重组腺病毒疫苗对绵羊进行肌内接种，发现这两种疫苗均可对动物产生12周的保护，并且诱导T细胞对同一表位产生应答，导致记忆T细胞分化，因此在动物感染PPRV后，重组腺病毒疫苗可促使T细胞扩增，对接种动物起到一定的保护效果。

2.5 血凝素蛋白基因组结构及功能

PPRV的血凝素蛋白(HN蛋白)长1 852 bp，编码609个氨基酸，分子量为70 kD。NH蛋白是一种II型膜糖蛋白，是PPRV的两种糖蛋白之一，以二硫键相连的二聚体或四聚体形式存在于病毒囊膜表面[38]，负责将病毒粒子附着在宿主受体上，通过调节病毒的吸附和侵入来决定致病性，释放新产生的病毒颗粒。NH蛋白其N端位于病毒内部，C端位于病毒外部，组成了PPRV囊膜表面的另一种纤突，可以作为配体与受体结合，使病毒感染宿主细胞。NH蛋白有血凝素和神经氨酸酶的双重活性，可以将病毒附着在宿主细胞表面，并裂解宿主糖蛋白的唾液酸残基。PPRV-HN基因的过表达可以促进病毒的增殖[39]。Liang等[40]第一次在PPRV-HN基因上发现了一些基因位点，随后Kimura等[41]报道在亚洲流行的基因型D3、D5、D9和H1中，297株同源病毒的HN基因有8个基因位点。Xue 等[42]对亲环素A(Cyclophilin A, Cyp A)进行了研究，首次发现Cyp A可以通过降低肽基脯氨酰基顺/反异构酶的活性来抑制PPRV在山羊细胞内的复制，但PPRV-HN蛋白可诱导宿主的溶酶体途径来降解Cyp A，从而以促进病毒进行复制，因此可证明HN蛋白在PPRV的复制调控中有着一定的作用。在PPRV中HN蛋白与其他病毒的蛋白相比同源性最低，是最易变异的蛋白，但其抗原性最强，能诱导机体产生中和性抗体。HN蛋白存在于PPRV粒子囊膜表面，可做为宿主免疫应答的主要靶点，不仅能刺激细胞免疫，而且具有一定的体液免疫作用，是开发新一代高效基因工程疫苗的良好靶基因。Hashiguchi等[43]对同源病毒MV-HN基因受体复合物的晶体结构和功能进行了探究，发现MV-HN表面仅露出一小部分区域用于受体和抗体结合，并且大部分MV-HN单克隆抗体都被映射到该暴露的受体结合区域，表明该区域可作为表位热点，该研究揭示了麻疹病毒的部分感染机制，这些区域位点在致病性、种间传播及免疫反应中发挥着重要的作用。

2.6 大蛋白基因组结构及功能

大蛋白(L蛋白)全长6 643 bp，编码2 183个氨基酸，预测分子量为247 kD，是PPRV中最长的多功能催化蛋白。L蛋白由两个铰链区分开，形成三个保守区域，区域1负责与P蛋白结合、区域2是RNA聚合酶的功能区、区域3是ATP的结合位点[44]。L蛋白可与P蛋白作用同时发挥RNA聚合酶活性，负责RNA的复制和转录[45]。Ansari等[46]通过使用洗涤剂破坏甘油梯度来分离纯化PPRV得到RNP复合物，再用纯化的RNP复合物从PPRV mRNA的核苷酸中提取出的三磷酸末端RNA检测三磷酸酯酶(RNA triphosphatase，RTPase)活性，发现当PPRV-L蛋白存在于纯化病毒的核糖核蛋白复合体中，以及在昆虫细胞内表达的重组L-P复合物中，均具RTPase活性。此外L蛋白C末端的极小区域(aa1640～1840)可在大肠埃希菌中表达，并显示出RTPase活性，同时还发现L蛋白RTPase的比活性高于RTPase结构域，这可能是由于L蛋白与RTPase结构域的折叠方式的差异。Baron等[47]通过敲除PPRV中整个RNA聚合酶基因，发现一个缺少L聚合酶基因的复制子可以在表达L蛋白的细胞系中复制，并且复制效率接近于亲本病毒，但是由于缺少完整的L基因使这种复制子不能在其他任何细胞中复制，因此L基因的缺失会影响病毒的复制。

2.7 C蛋白基因组结构及功能

C蛋白是由P基因翻译而来，包括117个氨基酸，是小反刍兽疫病毒所有蛋白中最小的一种，预测分子量为20.11 kD，等电点为10.73。对C蛋白进行研究发现PPRV与RPV序列长度相同，比CDV、PDV的蛋白多3个氨基酸。Yang等[48]利用羊的子宫内膜上皮细胞(EECs)进行试验，发现PPRV可诱导EECs发生自噬反应，是由非结构蛋白C和结构蛋白N介导的，并首次表明PPRV诱导的自噬抑制了宿主细胞的凋亡，从而有助于增强病毒的复制和成熟。C蛋白可与L蛋白结合并相互作用，参与病毒RNA的合成和阻断Ⅰ型干扰素(干扰素α、β)的产生及其信号通路的传导[49]，到目前为止，关于PPRV-C蛋白的功能特征还不是非常清楚，有必要进行更加深入的探索和研究。

2.8 V蛋白基因组结构及功能

在麻疹病毒属的全体成员中，不相同病毒V蛋白的长短也各有不同，其中小反刍兽疫病毒编码298个氨基酸，CDV和RPV编码299个氨基酸，预测分子量为32.28 kD，等电点为4.37。张海瑞等[14]模拟mRNA的编码过程，对PPRV-P基因的保守序列(UUAAAAAGGGCACAG)进行了定点突变，即在691位点插入一个G碱基，从而获得PPRV-V基因，与此同时研究人员对V蛋白的三级结构建模并进行预测，认为V蛋白由N-端结构域(含3个α-螺旋)、中间结构域(含多个β-转角)和C-端结构域(存在7个半胱氨酸残基)组成，并预测PPRV-V蛋白的主要功能是参与该病毒的复制和致病。严欢等[50]将获得的V蛋白与真核表达质粒pEGFP-N2连接后转染到Vero细胞中，通过荧光蛋白对V蛋白进行定位，发现磷蛋白及其编码的非结构蛋白均位于胞浆内，是由于RNA病毒不能进入细胞核进行复制，所以非结构蛋白V只能在胞浆内进行表达。V蛋白可直接参与信号转导和转录激活因子1(STAT 1)和STAT 2相互作用，导致宿主的IFN应答受损[23]。Chinnakannan等[51]对PPRV、RPV、CVD、MV四种病毒的V蛋白进行研究并提出了多种作用机制，发现这四种病毒的V蛋白都是Ⅰ型干扰素基因转录的有效阻滞剂，且与Ⅱ型干扰素诱导基因转录能力不同，由此证明不同病毒阻断Ⅰ型和Ⅱ型干扰素信号传导的机制是不同的，和它们与STAT 1的亲和力不同有关，同时还发现其不但能阻断Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干扰素(IFN-γ)的信号通路，而且能干预干扰素相关激酶Tyk 2的磷酸化，起到抵抗干扰素的作用，这项研究表明了麻疹病毒V蛋白靶向干扰素信号通路的多个成分具备控制Ⅰ型和Ⅱ型干扰素作用的能力。

3 展 望

到目前为止，全世界已有49个国家和地区正在发生或已经发生过小反刍兽疫，该病给各国的畜牧业发展造成了一定的影响，并且还具有向其他国家蔓延扩散的趋势。基于目前对PPRV的研究，基因突变的发生频率也在逐年增加，自2013年至2017年以来研究发现，我国PPRV基因突变位点的数量与PPRV的流行时间呈正相关，在H基因发生突变的41个核苷酸位点中有24个导致了氨基酸序列的改变，在P基因的47个核苷酸变异位点中有26个导致了氨基酸序列的改变，表现出H基因的非同义突变率高于P基因的现象，因此持续实时监测PPRV各基因分子变异，对防控该病具有重要意义[38，52]。PPRV-H蛋白的胞外球状头部含有抗原表位，可作为重要的抗原蛋白，能够刺激机体产生中和抗体，但对于我国PPRV流行毒株H蛋白氨基酸改变能否导致其抗原性改变，还需进一步研究。

对小反刍兽疫的预防仍然依赖于疫苗的研发，为此要加强对PPRV的免疫调节和致病机制的研究，虽然PPRV传统疫苗临床应用还存在一定的缺陷，但研发新型基因工程疫苗和DIVA疫苗仍是未来控制小反刍兽疫新流行的重要手段。