硒蛋白生理功能研究综述

刘成龙，田宗仁，张 克，薛文通

（1 中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京100083 2 中硒健康产业投资集团股份有限公司 湖北恩施445000）

硒（Se）作为一种人类必需的微量元素，几乎存在于所有生命体中，其具有抗氧化、抗肿瘤，预防心血管疾病，增强机体免疫力，保肝及解毒等生物学功能，对人体健康具有重要意义[1]。硒缺乏可以引起克山病、大骨节病等疾病，这些疾病给我国缺硒地区造成了严重的影响[2-3]。人体中的硒元素必须从体外摄取以满足自身健康需要。硒化物的种类繁多，有无机硒和有机硒2 种形态。硒元素在动、植物体内主要以硒蛋白（selenoprotein）的形式出现。

硒蛋白是指硒以硒代半胱氨酸（Selenocysteine，Sec）形式通过氨基酸脱水缩合作用结合到肽链上所形成的蛋白质[4]。动物体内的硒元素主要来自于食物，膳食硒蛋白经消化水解为硒代甲硫氨酸和硒代半胱氨酸，并被人体吸收[5]。硒在生物体中主要以硒代半胱氨酸和硒代甲硫氨酸的形式存在。硒蛋白中硒代半胱氨酸大多处在活性位点上，使其具有特异的功能特性[6]。与其它氨基酸不同，直接膳食摄入的硒代半胱氨酸并不能直接应用于硒蛋白的合成，必须经过复杂的合成机制重新合成，才可参与合成硒蛋白，起到对生物体有益的作用[7]。人体内具有重要生理功能的硒蛋白有多种，在神经系统发育，免疫功能调节，疾病的预防与治疗等方面起着重要作用[8]。研究硒蛋白合成代谢及生理功能，有利于对硒元素的合理应用，以改善人体与动物的健康状况，因此长期以来是国内外营养学和医学研究的热点问题。

1 硒蛋白的合成机制

硒元素对人体的有益作用主要是通过硒蛋白实现的。通过研究硒蛋白结构证实：硒代半胱氨酸在硒蛋白活性部位普遍存在，对硒蛋白的生理活性具有重要意义。目前在人体中共发现25 种蛋白质[6]。

硒以硒代半胱氨酸形式插入硒蛋白序列中。编码Sec 的密码子为UGA，被普遍认为是第21 种氨基酸。Sec 与其它20 种氨基酸合成方式不同，具有高度特异的合成途径，具体机制如图1所示[9]：首先，转运硒代半胱氨酸的RNA（tRNA[Ser]Sec），在丝氨酸-tRNA 合成酶（SERS）作用下与丝氨酸结合发生酰化，形成Ser-tRNA[Ser]Sec；然后，Ser-tRNA[Ser]Sec在激酶（PSTK）作用下磷酸化，形成pSer-tRNA[Ser]Sec；最终，Sec 合成酶（SPS2）催化pSer-tRNA[Ser]Sec与硒供体H2SePO3-生成Sec-tRNA[Ser]Sec。硒代半胱氨酸tRNA 被认为是丝氨酸的tRNA[10]。

图1 硒代半胱氨酸合成机制Fig.1 Synthesis mechanism of selenium cysteine

2 硒蛋白的代谢

膳食补充是人们摄入硒的主要方式，硒代蛋氨酸是膳食中硒的主要存在形态。硒的吸收发生在动物的十二指肠，不同形态的硒具有不同的吸收机制，膳食中的硒蛋白经水解产生硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸[11]，其中，被吸收的SeMet 有2 条转化途径：首先SeMet 通过转硫途径转化为硒代半胱氨酸参与硒蛋白的合成过程[12]，其次，SeMet在体内通过胱硫醚γ 裂解酶降解为甲基硒醇，与S-腺苷甲硫氨酸通过甲基化作用转化为二甲基硒化物/三甲基硒化物，并通过去甲基化转化为硒化物参与硒蛋白的合成过程[11]。硒代半胱氨酸通过硒代半胱氨酸裂解酶催化分解为硒化物和丙氨酸。硒化物在硒磷酸合成酶的作用下与三磷酸腺苷反应生成硒磷酸，直接参与硒蛋白合成[13]。硒的代谢过程主要是在肝脏中完成的，硒蛋白P 为血浆蛋白负责对硒的转运[14]。当摄入体内的硒过量时，肝脏会将Se 以谷胱甘肽过氧化物酶1 的形式储存，或者直接将其转化为硒糖或硒离子形式排出体外[11]。

3 硒蛋白的功能特性

3.1 调节氧化应激

硒的抗氧化作用主要通过硒代半胱氨酸参与构成的硒蛋白来实现[6]。目前，功能已知的真核生物的硒蛋白中大部分是氧化还原酶，具有抗氧化作用，主要有谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPx）、硫氧还蛋白还原酶（TrxR）、硒蛋白W 等。GPx 与TrxR 抗氧化的机制主要体现在清除机体的自由基（FR）。硒的抗氧化作用主要是由硒蛋白参与构成的酶来实现[15]。

脊椎动物体内存在8 种谷胱甘肽过氧化物酶，其中GPx1-4 和一些种类的GPx6 均含有硒元素，具有抗氧化功能[16]。GPx1 是第1 个被鉴定出来的哺乳动物硒蛋白。GPx 能够催化硫醇还原过氧化物，主要还原剂是谷胱甘肽（Glutataione，GPx），其催化反应式为：ROOH+2GSH →ROH+H2O+GSSG。随着与GSH 结合相关的精氨酸残基的减少，从GPx1 到GPx4 对GSH 的特异性逐渐降低，催化底物种类范围扩大。对GPx 催化动力学研究发现其符合乒乓模式，没有典型的酶底物复合物形成[17]。Bortoli 等[18]以磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶（GPx4）及其半胱氨酸（Cys）和碲半胱氨酸（Tec）突变体作为模型，通过分子动力学模拟和密度泛函计算方法以及电脑对S，Se，Te 3 种氧族元素的酶活性位点作用机制进行分析，结果表明，Cys 和Sec 酶通过电荷分离形成中间体，将硫醇/硒醇还原为次磺酸/次硒酸，而Tec 突变体则为直接氧化途径。分析Cys-GPx 和Sec-GPx 抗氧化特性，发现Sec-GPx 具有较低的能量壁垒，因此具有较高的抗氧化活性。

TrxR 是一种具有抗氧化作用的硒蛋白，包含黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide，FAD）结构，与硫氧还蛋白（Thioredoxin，Trx），辅酶NADPH 构成抗氧化系统。其中，TrxR能够催化NADPH 将氧化态Trx 中的二硫键还原成巯基，使其转变为还原态。Yamamoto 等[19]从蓝藻中提取TrxR 基因，经PCR 扩增导入大肠杆菌表达，结果证实TrxR 对蓝藻光合作用中产生的活性氧有消除作用。Drechsel 等[20]通过极谱法实时检测小鼠大脑线粒体中的H2O2，结果发现当使用金诺芬和1-氯-2，4-二硝基苯对TrxR 进行抑制时，H2O2的清除率降低80%，高于谷胱甘肽酶系统被抑制后H2O2清除率的降低比率，说明在大脑线粒体中抗氧化作用主要依靠硫氧还蛋白系统。

3.2 调节免疫功能

许多硒蛋白都可以在免疫细胞中表达，起到抗氧化，促进某些细胞在激活过程中的信号传导等作用，对哺乳动物的免疫调节具有重要影响[21]。硒蛋白参与免疫调节机制有多种，主要包括抗氧化介导和免疫因子介导2 种形式[22]。当细菌等微生物侵入哺乳动物机体时，中性粒细胞和巨噬细胞产生活性氧（如·O2-，H2O2，·OH，NO·，ONOO-等）对病原体进行氧化，同时，活性氧还是吞噬细胞和非吞噬免疫细胞间信号传递媒介，是细胞免疫必不可少的物质。然而，过多的活性氧在杀伤病原体的同时，对正常机体组织也会产生损伤，并引起过度免疫的发生，因此必须清除活性氧以保护自身免受损伤[21]。Won 等[23]分离了正常型和GPx1基因敲除型小鼠的淋巴结细胞及脾细胞，制备单细胞悬浮液，用CD3 对其激活，测定其活性氧含量，然后采用细胞内因子标记的流式细胞技术鉴定辅助T 淋巴细胞1 和17，结果表明，GPx1 缺乏使活性氧含量升高，GPx1 缺陷型辅助T 淋巴细胞倾向分化为辅助T 淋巴细胞1，说明GPx1 通过活性氧的调控，影响T 细胞增值和分化。

白细胞介素2 是一种多功能免疫调节因子，能够促进T 细胞增殖，诱导T 细胞产生细胞因子，如γ 干扰素等[24]。李瑞敏[25]通过构建硒蛋白K 表达的干扰载体，转染小鼠T 淋巴细胞，然后利用CD3 体外激活T 细胞，结果显示：受到干扰的T 细胞在激活后钙离子浓度和白细胞介素2 受体α 的mRNA 水平均低于对照组T 细胞，说明硒蛋白K可以通过影响内质网钙稳态蛋白调节细胞激活过程中的钙离子浓度，同时影响白细胞介素2 的表达。

3.3 调节内质网应激

内质网广泛存在于真核细胞中，对蛋白质加工、修饰、类固醇激素合成等具有重要作用[26]。

当内质网中长期过多存在未折叠或错误折叠蛋白、钙稳态失衡时，可导致内质网应激反应。如果不能对其进行调节，内质网就会激活相应的信号通路，诱导细胞凋亡。多种硒蛋白具有内质网应激调节功能。15 ku 硒蛋白是一种内质网硒蛋白。汪玉娟[27]采用衣霉素诱导内质网应激发现15 ku硒蛋白可以激活内质网c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）凋亡通路，与分子伴侣重链结合蛋白（heavy-chain binding protein，BIP）变化趋势一致，而BIP 可以防止多肽链的错误折叠和新合成蛋白质转运过程中的断裂，从而证实15 ku 硒蛋白在调节细胞凋亡和促进蛋白质正确折叠方面具有重要作用。然而，Tian 等[28]利用酵母双杂交体系筛选提取15 ku 硒蛋白和蛋白黄醇脱氢酶11（RDH11），并采用荧光共振能量转移、免疫共沉淀、蛋白质体外结合试验方法鉴定视黄醇脱氢酶11（RDH11）与15 ku 硒蛋白的相互作用，结果表明：15 ku 硒蛋白过表达导致外源性RDH11 视网膜还原酶活性下降，从而说明15 ku硒蛋白对内质网应激的调节作用复杂，目前尚未弄清其调节机制。

硒蛋白S 作为一种内质网硒蛋白，同样具有调节内质网应激作用功能。Ye 等[29]利用RNA 干扰技术使血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）中硒蛋白S 表达，采用MTT 法、DNA荧光染色法、膜联蛋白V/碘化丙钠染色法检测发现，硒蛋白S 基因沉默使VSMCs 对过氧化氢或妥尼卡霉素诱导的损伤和凋亡更加敏感，使过氧化氢诱导的VSMCs 中p38 MAPK 和c-Jun n-末端激酶（JNK）的氧化应激和磷酸化加剧，使过氧化氢或妥尼卡霉素诱导的内质网应激增强，表现为伴侣蛋白78 ku 葡萄糖调节蛋白（GRP78），蛋白激酶样内质网激酶（PERK），促凋亡转录因子C/EBP同源蛋白（CHOP）含量升高。这些结果说明硒蛋白S 有抑制内质网应激的功能，可以保护细胞免受过度内质网应激导致的损伤。然而，Speckmann 等[30]发现对人结直肠癌细胞、人结肠癌细胞株、人克隆结肠腺癌细胞进行RNA 干扰，可减少硒蛋白的表达，却没有引起或调节内质网应激，也不能抑制H2O2导致的细胞凋亡。由此推断，硒蛋白S 内质网应激和氧化应激作用的调节与细胞种类相关。

3.4 调节激素代谢

脱碘酶是一种膜结合蛋白，对甲状腺激素代谢具有重要的调节作用。其主要位于细胞内质网上，有3 种类型：Ⅰ型脱碘酶（ID1）、Ⅱ型脱碘酶（ID2）、Ⅲ型脱碘酶（ID3）。对小鼠进行缺硒喂食发现，严重缺硒状态下其甲状腺、肾脏和肝脏中ID1活性最高，且在肾脏中主要使T3（三碘甲状腺原氨酸）的浓度降低，具有清除作用，而在甲状腺和肝脏中，特别是甲亢小鼠体内，T3 含量升高；ID2的活性也显著增加，大脑皮层中活性增加19 倍，甲状腺、棕色脂肪组织和垂体增加6 倍，而ID3 的活性未检出，说明ID1 对T3 具有双向调节作用，而ID2 主要起到催化产生T3 作用，且不同组织中3 种脱碘酶的表达具有差异[31-32]。甲状腺主要分泌T4，分泌的T3 小于20%，T3 主要由脱碘酶1/2 催化T4 脱碘产生。Bassett 等[33]对骨细胞中所含脱碘酶3 的研究发现，ID3 主要通过内环脱碘作用催化T4→rT3，T3→T2，降低T3 含量，增加无生理活性的rT3 和T2。ID1、ID2 和ID3 构成对甲状腺激素的完整调节系统。

Harada 等[34]测定7 例甲状腺全切除患者血清FT3、FT4、促甲状腺激素（TSH）水平，并对11 例甲状腺乳头状癌患者的甲状腺乳头状癌组织中甲状腺组织中ID1、ID2 的活性及mRNA 水平进行检测，发现桥本氏甲状腺炎（huge goitrous Hashimoto's thyroiditis，HG-HT）患者的ID1 和ID2 活性与甲状腺体积有很强的相关性，这些发现提示淋巴细胞浸润、纤维化和甲状腺细胞增生（被认为是导致HG-HT 甲状腺肿大的主要原因）可以导致这些甲状腺组织中较高的D1 和D2 活性升高，而ID1和ID2 的mRNA 浓度没有显著变化，说明桥本氏甲状腺炎对D1 和D2 活性是在翻译后调控的。甲氧咪唑（MMI）和丙基硫脲（PTU）通过干扰甲状腺过氧化物酶（TPO）介导的碘的氧化和有机化，对甲状腺激素的生物合成具有类似的抑制作用。Yoshihara 等[35]采用FRTL-5 大鼠甲状腺细胞进行DNA 微阵列分析、实时PCR、蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色和共聚焦激光扫描显微镜观察，研究MMI 和PTU 的作用机制，结果表明，促甲状腺激素（thyrotropin，thyroid stimulating hormone，TSH）、胰岛素和血清可以增强ID1 mRNA 水平，而碘和甲状腺球蛋白滤泡浓度则抑制ID1 mRNA 水平，MMI 和PTU 对TSH、胰岛素和血清诱导的ID1 表达具有明显的抑制作用，MMI 在没有TSH 的情况下可以抑制ID1 的表达，而PTU 在没有TSH 的情况下抑制作用微弱。这些结果表明PTU 和MMI 可能通过不同的机制调控ID1 的表达，TSH 可能在调节甲状腺细胞PTU 和MMI 信号中发挥重要及不同的作用。

3.5 调节炎症反应

炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子所产生的复杂防御反应。在炎症过程中，机体可以通过一系列血管反应，如白细胞渗出等，对损伤因子进行稀释、中和、杀伤，同时又会通过实质和间质细胞的再生使得受损的组织得到修复和愈合[36]。Dhanjal 等[37]将小麦富硒提取液与重组蛋氨酸酶（提高硒的生物利用率）加到细胞培养液中培养RAW264.7 巨噬细胞72 h，然后采用脂多糖刺激培养的细胞，结果发现巨噬细胞中的硒蛋白谷胱甘肽过氧化物酶1（GPx-1）的表达增强，进而抑制COX-2、mPGES-1、iNOS 的表达，达到抗炎效果。Liu 等[38]将72 只1日龄小鼠分为2 组，分别喂食含硒食物和缺硒食物，42 d 后，采集所有小鼠的骨骼肌和血液样本，对谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、谷胱甘肽（GSH）的活性，炎症因子（包括TNF-α，一氧化氮合酶、环氧酶-2 和前列腺素E合成酶）的mRNA 和蛋白表达水平，NF-κB 的蛋白表达水平，小鼠骨骼肌热休克蛋白的信使RNA表达水平进行检测，结果表明，硒缺乏导致小鼠骨骼肌GPX、GSH 活性降低，进而导致炎症细胞因子mRNA、蛋白表达水平升高，热休克蛋白mRNA表达水平升高。硒蛋白W 同样具有抗炎症作用。如：Yu 等[39]采用小干扰RNA 对淋巴细胞硒蛋白W 基因进行敲除，并用H2O2刺激试验细胞，结果发现基因敲除细胞的炎症因子（iNOS，COX-2，NF-κB，PTGEs，TNF-α）信使RNA 表达高于基因未敲除细胞，推断硒蛋白W 主要通过影响炎症因子的基因表达来实现对炎症因子的调控，对由H2O2氧化应激引起的炎症反应起到防御作用。

3.6 调节硒平衡

肝脏作为硒的主要储存器官，储存大量的硒以供硒缺乏时全身使用。Lei 等[40]发现缺硒条件下，小鼠肝脏中硒蛋白Gpx1 的含量急剧下降到正常状态的12%，而其它组织中硒含量没有明显降低，表明Gpx1 作为体内一种硒的储存形式，在硒缺乏时分解以保证其它组织内的硒供应。小鼠全身29%的硒存在于肝脏中，50%的肝脏硒存在于硒蛋白Gpx1 中[41]。

硒蛋白P1（Sepp1）是血浆硒转运蛋白，90%以上的小鼠血浆硒蛋白P 是由肝脏合成的，研究表明血液中的硒主要与Seep1 结合，作为人体内多种器官硒供源[11]。采用基因敲除技术对小鼠的Seep1 基因进行敲除，发现基因敲除小鼠肝脏中的硒含量显著升高，而大脑、睾丸等组织中硒含量降低，出现神经系统功能障碍且雄性出现不育现象。从而证实肝脏是硒储存和调控器官，Seep1 作为转运蛋白将肝脏中的硒运往其它组织，供其应用[42-43]。Schweizer 等[44]对小鼠肝脏中调节Sec 合成的tRNA（tRNA[Ser]Sec）基因进行特异性敲除后，使小鼠肝脏无法合成分泌硒蛋白，并对多种硒蛋白含量及活性进行检测，发现血浆中Sepp1 蛋白含量减少，同时肾脏中GPXs 表达及活力降低，对大脑中硒含量没有显著影响，说明大脑中硒的供应优先于其它组织器官。Seep1 的靶器官主要通过相应受体实现对硒的吸收。通过质谱分析发现睾丸中Seep1 与载脂蛋白E 受体-2（Apolipoprotein E receptor-2，ApoER2）结合物；对小鼠载脂蛋白E受体-2 基因进行敲除，发现小鼠大脑受到损伤，说明睾丸和大脑中的Seep1 受体为ApoER2[45]。肾脏中Seep1 受体与睾丸和大脑不同。Kurokawa 等[46]对小鼠megalin 基因进行敲除，通过质谱法发现小鼠尿液中存在Seep1 的N 端片段，且细胞中Gpx3含量降低，表明肾脏中Seep1 受体为megalin 受体，采用内吞作用吸收血液硒，用于和合成Gpx3。

3.7 重金属拮抗作用

硒具有重金属拮抗作用，能够保护动、植物免受重金属的伤害。临床研究证实，通过对高血铅孕妇补充有机硒进行干预，分娩前干预组血铅含量显著低于对照组[47]；对长期暴露于富铅环境下的工人进行血清硒与血清铅含量分析，发现血现清硒浓度高的工人的血铅水平明显低于血清硒浓度低的工人的血铅水平[48]。Francis 等[49]发现提高溶液中硒的水平，能明显低植物体内的镉浓度。硒可以通过多种方式减少重金属在植物体内的蓄积，缓解毒害作用。首先，硒蛋白能够抑制重金属的吸收，并促进重金属在体内的排泄[50-51]；其次，硒蛋白对重金属引起的氧化应激有抑制作用，同时减少重金属对生物体内抗氧化系统的破坏[52]；再者，硒蛋白能够拮抗重金属对生物体内免疫系统造成的损伤[53]。另外，硒蛋白还可以帮助植物体内重建叶绿体，增加叶绿素的含量，以缓解重金属对叶绿体的损伤[49]。

Liu 等[54]建立一个鸡模型来研究铅和硒，将7 d 大的雄性鸡随机分为对照组、+Se 组、+Pb 组和Se+Pb 组，并于第30、60 和90 天检测鸡心脏中4个炎症因子【核因子-κB（NF-κB）、肿瘤坏死因子-α，环氧合酶-2 和前列腺素E 合成酶】和25 种硒蛋白【包括谷甘肽过氧化物酶1（Gpx1）、Gpx2、Gpx3、Gpx4，硫氧还蛋白还原酶1（Trxp1）、Trxp2、Trxp3，脱碘酶1（Dio1）、Dio2、Dio3，硒蛋白n1（Sepn1），硒蛋白质K（Selk）、Sels、Sepw1、Selt、Selh、Selm、15 ku 硒蛋白、Seli、Selu、Selpb、Sepp1、Selo、Sepx1、硒磷合成酶2（SPS2）】的mRNA 相对表达水平。结果表明，铅中毒可引起鸡心脏炎症因子mRNA 水平升高，硒蛋白mRNA 水平降低，心脏组织学改变，补充硒，通过抑制NF-κB 信号通路和刺激鸡心脏硒蛋白来减轻Pb 诱导的炎症损伤。

3.8 疾病预防与治疗作用

通过大量的流行病学研究发现，硒与人体多种疾病相关，从硒过量导致动物致盲到硒缺乏引起克山病、大骨节病等，人们对硒与人体健康的认识越来越深入[55]。目前，已经发现硒与癌症、艾滋病、心血管疾病、先兆子癫、Ⅱ型糖尿病、甲状腺疾病、神经系统疾病等疾病均具有重要关联[56]。Bertz等[57]采用shRNA 介导敲除人结肠癌细胞中的硒蛋白H 基因，并通过伤口愈合试验、动物试验、免疫组织化学、蛋白质印迹分析和细胞周期测定等方法对硒蛋白H 含量、细胞迁移和细胞周期进行分析，结果发现细胞中硒蛋白H 的表达受到硒的浓度和形态的影响，且肿瘤组织、小鼠未分化上皮细胞和结直肠癌细胞系中硒蛋白H 表达得到加强。基因敲除试验结果显示：硒蛋白H 减少降低了细胞的分化，增加了细胞的增殖和迁移，硒蛋白H基因敲除细胞更易于形成移植瘤，并具有更快的细胞变化周期。在肿瘤以及未分化的增殖细胞中，高水平的硒蛋白H 可以抑制细胞增殖和G1/S 转变，说明硒蛋白H 通过调节细胞增殖过程中G1期向S 期的转变，从而防止细胞不可控增殖的发生。

Ingold 等[58]等采用基因突变技术使小鼠GPX4的调控基因发生突变，第2 代纯合子Gpx4cys/cys小鼠（该类型小鼠分泌的Gpx4 中所有的硒半胱氨酸均被半胱氨酸取代）占28%，符合孟德尔定律，说明具有硒酸盐的催化作用的GPX4 对哺乳动物胚胎的正常发育没有必然作用，而所有纯合子Gpx4cys/cys小鼠PV+神经元细胞减少，出现癫痫或兴奋过度症状，并在18 d 内全部死亡，即说明含有硒代半胱氨酸的GPX4 对特定类型的中间神经元是必不可少的，可以预防癫痫的产生，因为神经元细胞中含有高含量的为神经网络形成、迁移和神经递质释放所必需的多不饱和脂肪酸，而硒代半胱氨酸的GPX4 具有的抗氧化性，能够保护细胞因脂质过氧化诱导而导致的铁死亡。

4 结语

硒蛋白的种类较多，对人体健康的影响复杂多样，且影响机制尚不清楚，还需进一步研究。硒蛋白具有诸多生理功能，目前市售补硒产品较少，消费者的接受度较低，需加强针对相应人群富硒产品的开发，生产复合型的硒营养强化剂。