小型猪模型在人类内分泌代谢性疾病研究中的应用进展

梁靓陈奎蓉程锋田威龙高九昱兰干球梁晶

(广西大学动物科学技术学院,南宁 530004)

内分泌代谢性疾病包括糖尿病、肥胖症、骨质疏松症和痛风等以体内碳水化合物、脂类物质、蛋白质代谢障碍为特征的生理紊乱性病症[1],其中糖尿病已成为继心血管疾病和肿瘤之后的第三大非传染性疾病,严重威胁人类健康。近年来,我国更是成为世界上糖尿病第一大国[2],其它内分泌代谢性疾病亦成为困扰人们正常生活的常发病[3-5]。虽然内分泌代谢性疾病患病率呈逐年升高的趋势[6],但由于对发病原因、致病机制以及治疗靶点尚无确切阐明,使之成为人类健康的长期困扰,开展相关机制研究已成为人类医学研究的热点之一。其中,构建适宜的动物模型,是对内分泌代谢性疾病深入研究的重要基础。

利用啮齿类动物模型开展疾病研究是目前比较成熟的手段[7],但因其与人类在遗传背景、组织结构、生理代谢及发病机制等方面还存在一定差距,因此,制备生理病理特征与人类更为相近的实验动物模型非常必要。非人灵长类动物作为一种临床前动物模型,不仅在基因水平上和人类极为相似,而且在内分泌代谢性疾病的研究中可以更加确定药物对人类的安全性和有效性[8],但其局限是可供研究的动物数量有限、研究费用较高、实验技术与设备普及程度较低,还可能会面临伦理问题[9]。近年来,国内外学者开始应用小型猪构建内分泌代谢性疾病模型,由于其在生理生化指标、解剖结构、饮食特点、药物代谢和疾病发生发展等方面与人类十分相似,越来越多的研究人员开始对小型猪疾病模型展开更为全面深入的研究[10-13]。本文对应用小型猪构建内分泌代谢性疾病动物模型的研究进展进行综述。

1 建模小型猪品系及来源

小型猪品系繁育工作在欧美等发达国家先于我国开展,当前包括日本、捷克、美国、德国和法国等地区的小型猪品系已广泛用于科学研究,国内小型猪品系也依据地域特点拥有各自优势[14]。同时,各地区亦不断开展新品系的繁育工作。

1.1 国外小型猪

发达国家地区通常采用异地异源猪种杂交的方法进行品系繁育工作,因此小型猪血缘繁杂、遗传基础差异大[15]。目前,国外已报道的不同小型猪品系信息如表1 所示。以往的报告指出,国际上常用于科学研究的小型猪品系包括:美国明尼苏达-霍麦尔(Minnesota-Hormel)品系,源自卡塔利娜岛野猪(Catalina Island pig)、几内亚野猪(Guinea hops)、皮纳森林野猪(Piney woods rooters)和关岛猪(Rasnlansa pig)的杂交繁育[16],为首例小型猪品系,于1949年完成;美国皮特曼-摩尔(Pitman-Moor)品系,源自佛罗里达半岛内野猪的选育[17],由皮特曼-摩尔制药公司完成;美国汉福德(Hanford)品系,源自皮特曼-摩尔品系小型猪和派洛斯猪(Palouse pig)杂交后代与拉布哥猪(Labco pig)的杂交繁育[18],由亨浮尔德研究所完成;美国艾塞克斯(Essex)品系,源自德克萨斯州内猪种选育[19];美国尤卡坦(Yucatan)品系,源自尤卡坦半岛内野猪和美国中部野猪的杂交繁育[17];美国奥萨博(Ossabaw)品系,源自佐治亚州奥萨博岛内野猪的选育[16];美国内布拉斯加(Nebraska)品系,源自皮特曼-摩尔品系小型猪和洪都拉斯境内矮小猪的杂交繁育[17];德国哥廷根(Gottingen)品系,源自明尼苏达-霍麦尔品系小型猪和越南小型野猪杂交后代与德国兰德瑞斯(Landrace)品系改良猪的杂交繁育[17];法国科西嘉(Corsica)品系,源自科西嘉岛内半野生猪的选育[17],以及日本的阿咪尼(Oh mini)、克劳恩咪尼(Clawn mini)和会津(Huei-Jin)等[19]小型猪品系。

相关研究表明,奥萨博和尤卡坦等品系小型猪具有节俭型基因,易通过特定饮食诱发高血压、肥胖、糖尿病和胰岛素抵抗等疾病[15],同时具有繁殖性能高、性情温顺和便于操作等特点,是主要应用于内分泌代谢性疾病建模的国外小型猪品系。

1.2 国内小型猪

天然封闭群特性和高度近交育种等先天条件[20]是我国小型猪繁育的主要优势,通过种源选育和近交繁殖可以保证猪群遗传背景清晰和表观性状稳定[21]。目前,国内已报道的不同小型猪品系信息如表2 所示。国内经过实验动物化培育的品系主要包括:王爱德等[22]对广西巴马地区固有香猪近交选育而获得的广西巴马小型猪,贵州从江地区固有香猪经过长期自然选择和人为定向培育而获得的贵州小型猪[23],陈明飞等[24]对川黔交界山区固有香猪引种和近交选育而获得的中国农大小型猪,海南地区固有香猪经过种源和近交选育而获得的五指山小型猪[25];西藏地区固有香猪经过种源选育而获得的西藏小型猪[26],潘伟荣等[27]对云南西双版纳地区固有香猪引种和近交选育而获得的版纳微型猪,以及甘南藏族自治州地区固有香猪经过长期自然选择和人为近交选育而获得的甘肃蕨麻猪等品系[28]。国内各品系小型猪通过实验诱导发病可表现出较为理想的疾病表征与生理药理代谢特点,对内分泌代谢性疾病的建模研究具有重要意义。

2 建模方法

内分泌代谢系统以反馈调节为主要机制在机体内发挥生理调控作用,下丘脑-垂体-靶腺体轴和内分泌腺-体液代谢物质之间均存在反馈调节[29-31]。细菌和病毒感染等外在因素,以及先天遗传和激素分泌异常等内在因素[32-33]均可导致反馈调节过程紊乱,诱导疾病发生。通过人为干预机体正常反馈调节过程,可以构建内分泌代谢性疾病实验动物模型。依据方法不同,一般分为自发型动物模型、诱导型动物模型、手术法动物模型和基因工程动物模型。

2.1 自发型动物模型

在自然繁育过程中,基因组出现突变导致表型发生特定改变后,通过回交和测交等方法人为干预,以选育出该表型稳定遗传的品系,是构建自发型动物模型的常用手段[34]。此种模型与人类疾病发生发展过程十分相似,被应用于高血压、糖尿病和肥胖症[35]的研究中,尤其适用于多基因诱导致病机制探讨和致病基因的筛选鉴定等方面[36]。适用于构建自发型模型的主要有哥根廷小型猪和尤卡坦小型猪两个品系[15],但由于饲养成本较高、实验条件苛刻,限制了此种方法的发展。

2.2 诱导型动物模型

表1 国外小型猪品系信息Table 1 Information of overseas miniature swine strains

通过特定饮食饲喂或化学药物注射,诱导实验动物发病是构建诱导型动物模型的常用手段。此种模型对研究人类疾病终末器官损伤等方面具有重要意义。高脂高糖饮食诱导一般用于高血压、糖尿病、肥胖症和痛风症等疾病的研究,链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)或四氧嘧啶(alloxan,ALX)注射诱导一般用于糖尿病和高血压等疾病的研究。相磊等[37]应用高脂高糖饮食诱导成功构建小型猪糖尿病模型后发现,饮食诱导可引起小型猪脂肪堆积,内脏脂肪堆积尤为明显,血液生化指标呈高脂血症并伴有肾功能损伤。Renner 等[38]应用高脂高糖饮食诱导成功构建小型猪糖尿病模型后发现,血清中GLP-1 浓度显著下降,并且与血糖浓度呈负相关(P＜0.05),吴延军等[39]通过高脂高糖饲料联合低剂量STZ 诱导成功构建小型猪糖尿病模型,全部实验小型猪均发生二型糖尿病症状,包括胰岛素抵抗和葡萄糖耐受损伤。戎亦骊等[40]应用高脂高盐饮食诱导成功构建小型猪高血压模型后发现,饮食诱导8周可建立小型猪高血压模型,其发病机制可能与影响肾功能进而激活RAS系统和AVP-AQP-2 有关。陈民利等[41]采用维生素D3 和异丙肾上腺素复合高脂饮食的方法建立了小型猪慢性心肌缺血模型,并利用无创遥测技术对小型猪慢性心肌缺血模型的症状进行检测与评价。由于此种建模方法具有较好的可控性与操作性,被研究者广泛应用。

表2 国内小型猪品系信息Table 2 Information of miniature swine strains in China

2.3 手术法动物模型

经由外科手术切除或改造动物内分泌代谢系统器官可以导致机体代谢紊乱,是构建手术法动物模型的常用手段。此种模型对于研究人类疾病器质性损伤引发的代谢异常及代谢代偿过程十分重要。全部或部分胰腺切除一般用于糖尿病和肥胖症等疾病的研究,肾手术法一般用于肾源性高血压的研究。Jung 等[42]通过胰腺切除构建小鼠糖尿病模型,发现胰腺部分切除手术能够一定程度上诱导小鼠产生糖尿病,并且诱导胰岛β 细胞的再生。赵鹏[43]通过对大鼠进行“两肾一夹”手术成功构建高血压模型,发现建模后12周,高血压大鼠心肌损伤和纤维化程度明显,而赖氨大黄酸可以缓解高血压大鼠心肌损伤和纤维化程度。由于应用小型猪构建手术法模型成本相对较高,此类研究结果报道相对较少。

2.4 基因工程动物模型

通过转基因、基因打靶和基因编辑等基因重组技术,人为地修饰、改变或干预生物固有DNA 组成,从而获得稳定遗传的动物品系,是构建基因工程动物模型的常用手段。此种模型对于研究人类疾病发病过程的分子机制、了解可能的致病基因和预防疾病的发生发展具有重要意义。单基因敲除、多基因敲除或线粒体突变常用于糖尿病和肥胖症等疾病的研究,DNA 靶向修饰技术常用于高血压的研究。Klymiuk 等[44]指出,应用基因敲除技术构建杜氏肌营养不良(DMD)和囊肿性纤维化(CF)模型猪,对该疾病的靶向治疗和安全性评价具有重要意义。刘玉敏[45]通过CRISPR 技术对西藏小型猪靶向基因进行编辑,发现GHR 杂合敲除西藏小型猪可以进行交配繁殖,以获得GHR 纯合敲除个体。袁益琳[46]应用CRISPR/Cas9 系统,结合体细胞核移植技术一步成功构建ApoE 纯合敲除猪模型,为通过小型猪建模了解动脉粥样硬化早期病理机制打下了坚实基础。

3 内分泌代谢性疾病动物模型研究趋势

构建适宜的内分泌代谢性疾病动物模型对于发现、验证和优化治疗方法,以及确保其安全用于人类是必不可少的过程。当前阶段用于构建相关疾病模型的实验动物主要有啮齿类、小型猪、大型动物类、非人灵长类等,每一种动物模型均有其优势和局限。了解各种动物模型的优缺点,对疾病的机理探索、靶向治疗和前期预防具有重要意义。

小型猪具有体积小、方便操作、易于饲养管理等优势,其解剖学、生理机能和代谢特点亦与人类较为相似。虽然猪比非人灵长类动物在遗传上与人类相距更远,但其繁殖周期更快、单胎产仔数更高,在多世代的动物模型研究中更具优势。相对于啮齿类动物,猪在进化上与人类更为接近,其基因组序列与人类具有更高的同源性,在消化吸收、营养代谢和内分泌代谢等方面也与人类较为一致。因此,在研究内分泌代谢性疾病方面,利用小型猪制作疾病模型,具有其他实验动物不可替代的优越性。不同品系小型猪以其各自特点适用于不同研究目的的建模实验中。尤卡坦品系、哥廷根品系、阿咪尼品系和培品托品系的小型猪性情温顺,十分适合需要反复操作和密切接触的长期研究当中;汉福德品系和哥廷根品系的小型猪被毛为纯白色,皮肤素沉积均匀,十分适合需要观察体表变化的研究;奥萨博(Ossabaw)小型猪是代谢综合征和2 型糖尿病的易感模型。由于疾病控制和产权保护等因素,国际间小型猪关联研究很难开展。目前,我国小型猪建模亦取得重要成果,Li 等[47]通过连续6周高脂高蔗糖饮食饲喂,成功构建巴马小型猪代谢综合征病理模型,并发现试验组小型猪出现高脂血症、脂质沉积、高胰岛素,以及由炎症因子等引发的肾小管上皮细胞凋亡增多,说明长期饮食诱导可引起巴马小型猪代谢综合征和慢性肾组织损伤。陈民利[48]在报告中指出,五指山小型猪和西藏小型猪在高脂饲养条件下均易产生动脉粥样硬化(AS),并伴随肥胖、高血脂、高血压、炎症和胰岛素抵抗等多种与人类相似的临床症状;但是,二者在AS 发病的病症特点和易感基因方面存在诸多差异,五指山小型猪适合于外周胰岛素抵抗的代谢性疾病模型研究,而西藏小型猪更适用于中心型胰岛素抵抗的心血管疾病模型研究。王郭琦等[49]的研究表明,腺嘌呤和地塞米松联用可以成功构建贵州小型猪肾阳虚模型,建模后小型猪表现出畏寒喜暖、生殖减退、精神萎靡和消瘦等典型肾阳虚症状。魏杰等[50]在报告中指出,中国农大小型猪具有基因纯、健康敏感和抗逆性强等特点,在代谢性疾病动物模型中具有重要作用。Gregory 等[51]的研究表明,通过部分结扎版纳微型猪胰腺可以构建慢性胰腺炎模型,其严重程度与结扎后饲喂时间呈正相关(P＜0.05)。石兴勇等[14]在报告中指出,我国目前各具特色的实验用小型猪品系需要增加投入,利用先进的科学技术例如基因编辑和动物克隆技术,加速小型猪的定向化培育进程。由此可见,各品系小型猪以其独有的优势,对不同建模方法呈现出极具特征的病理特点和外在病变表象,逐渐成为人类内分泌代谢性疾病相关研究的理想动物模型。

4 总结与展望

构建动物模型是研究人类内分泌代谢性疾病的关键手段,对降低该类疾病的发病率、保护人类健康具有重要意义。发达国家地区较早应用小型猪构建动物模型,我国应加强相关研究进度,并充分发挥本土小型猪优势。通过多种方式均可以构建内分泌代谢性疾病动物模型,应依据研究方向选择适合的建模方法,对疾病的致病途径、代谢特点、遗传易感性和治疗手段等方面分别阐明。综上所述,应用小型猪建立内分泌代谢性疾病动物模型对发病机制等相关问题的深入研究至关重要。随着建模技术和研究手段的不断发展,未来应加强在基因水平上的研究,用以全面了解相关疾病的遗传基础和可能的发病机制。