建立阿尔茨海默症人源肠道菌群动物模型

朱华刘小海李卓郭亚茜杜晓鹏苏磊李永宁∗秦川∗

(1. 卫健委人类疾病比较医学重点实验室,中国医学科学院医学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,北京 100021; 2. 中国医学科学院 北京协和医院,北京 100730)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种退行性中枢神经系统病变,起病隐匿,呈进行性发展。主要临床表现为记忆认知障碍、精神人格行为异常。神经原纤维缠结、老年斑沉积、神经元的广泛缺失是这种疾病的特征性病理改变[1-2]。目前AD 是世界上最常见的一种老年痴呆症,在中国患者数已超过600 万,60 岁人群中AD 的患病率为3%～5%。在世界范围AD 患者达3.5 亿,到2030年将超过6 亿,85 岁以上人群发病率可能超过50%。最近的研究表明,肠道微生物组与AD 之间存在密切关联[3-4],大量数据显示正常肠道菌群对机体脑功能的维持具有重要作用,而肠道菌群失调可能与AD 的危险因素如年龄、应激、肥胖和糖尿病等密切相关,并可能参与多种AD 伴发精神症状如焦虑、抑郁等的发病。

动物模型是研究肠道菌群与AD 关系的重要工具。无菌动物(germ free animal,GF)是通过无菌剖宫产或无菌胚胎移植术获得,在无菌状态下繁育,采用现有检测手段检测不到活的微生物、寄生虫的动物[5]。利用GF 小鼠移植人粪便构建的人源菌群动物(human-flora animal,HFA),通过在GF 小鼠体内模拟人的肠道微环境,为研究人肠道微生态系统提供了一个更为直接、有效的模型,其优势在于能有效控制宿主的遗传背景、菌群、饮食及其它环境因素[6-7]。本研究选用无菌小鼠为实验对象,通过粪菌移植方法将AD 患者肠道菌群移植到无菌小鼠体内,运用生物信息学、代谢组学方法结合动物的临床症状、组织病理学分析等手段对模型进行评价,为探索肠道菌群在AD 发生发展中的病理生理机制提供研究基础,为早期发现、治疗AD 提供研究工具。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

无菌级C57BL/6J 小鼠28 只,体重17 ～22 g均为雌性,课题组自己繁育并饲养于无菌隔离设施中。动物实验期间隔离器内温度22 ～25℃,湿度40% ～70%。动物在隔离器内自由摄食饮水。实验所用无菌小鼠饲料经50 kGy60Co γ 射线辐照灭菌,饲育用饮水、垫料、笼具、灌胃针等经126℃,30 min 的高温高压灭菌处理。隔离设施合格证号【SYXK-(京)2018-0019】。实验获本研究所实验动物使用与管理委员会批准(批准号:ZH17003)。

1.1.2 主要试剂与仪器

徕卡ASP300S 全自动组织脱水机、徕卡1150H+C 石蜡包埋机、樱花IVS410 石蜡切片机、Bio-Rad IQ5PCR 仪。Bio-Plex MAGPIX System 悬液微珠芯片平台。抗体芯片检测试剂盒Bio-Plex Pro Mouse Cytokine(货号M60013RDPD)。老年斑染色6E10抗体,Biolegend(货号IG-39320)。

1.2 方法

1.2.1 粪便供体信息

移植当日各有3 位阿尔茨海默症患者、3 位健康志愿者符合粪便供体标准(见表1)。患者及健康志愿者样品的采集已获得中国医学科学院北京协和医院伦理委员会批准,伦理审核号:S-K478。阿尔茨海默症患者及健康志愿者均来自中国北方,为典型非素食中国饮食。符合2011 版国际阿尔茨海默症诊断标准[8];排除非典型或继发性AD;无其它神经精神症状;消化道无器质性病变,未进行过手术;无酒精依赖、吸烟、糖尿病等代谢性疾病;粪便采集前4～8周内未服用益生菌、抗生素、非甾体类药物。

表1 实验志愿者信息Table 1 General information of the volunteers

1.2.2 建立粪菌移植模型

28 只6 ～8周龄无菌C57BL/6J 小鼠,雌性,分为健康对照组(CON)和阿尔茨海默症(AD)组,每组14只。收集志愿者清晨排出的新鲜粪便,无菌、厌氧条件下分别将健康人和AD 患者的粪便混匀。各称取1 g用100 mL 0.1 mol/L PBS(pH=7.2)溶解,振荡混匀后用无菌纱布过滤粪便残渣后制成粪便菌悬液。每只无菌小鼠经口灌胃接种0.4 mL 粪便悬液。

1.2.3 检测指标

接种粪便悬液后每天观察动物生长情况,每周测量体重。移植6周安乐7 只动物,移植10周安乐剩余,解剖时检测指标:

(1)16S rDNA 扩增子测序

动物在解剖前采集粪便。粪便收集在隔离器内完成,装入无菌冻存管传出,存入-80℃冰箱。动物实验结束后统一按参考文献[9]的方法提取基因组DNA、构建文库、上机测序并对结果进行分析。

(2)脑内及血中Aβ 含量测定

动物安乐死后,取血,血液用10000 r/min 离心10 min,取上清。冰盘上剥离脑组织分成两半,右半脑嗅球及小脑,用预冷的生理盐水冲洗,吸干水分后制成10%脑组织匀浆。酶联免疫吸附法测定血清及脑匀浆中Aβ40 和Aβ42 含量。

(4)细胞因子

使用抗体芯片技术检测血清种IL-1β、IL-10、IL-6、TNF-α、IL-33、TGF-β 等与脑部炎症相关的细胞因子。

(5)组织病理学

小鼠左侧大脑固定于中性福尔马林溶液,24 h内进行脱水、透明、浸蜡、包埋处理,制作横断面切片,厚度5 μm。切片隔3 取1,贴到经多聚赖氨酸处理过的玻片上,按照文献[10]的方法对小鼠海马和皮层内进行老年斑免疫组化染色,观察是否有老年斑生成。

1.3 统计学分析

数据以平均值± 标准差(±s)形式表示,分析使用SPSS 22.0 软件包,组间比较使用t检验,率的比较采用卡方检验。P＜0.05 表示具有统计学意义。

2 结果

2.1 症状和体征

从动物实验开始到被安乐时止,所有小鼠摄食饮水正常、毛色顺滑、精神良好。对照组动物体重增平稳,模型组小鼠从第5周开始体重增长加放缓,与CON 组比较,除第8周外差异无显著性(图1)。

图1 动物体重变化Figure 1 Changes of body weights in the CON and AD groups

2.2 16S rDNA 扩增子测序

2.2.1 菌群多样性检测结果

OTUs 数可直观反映样本中物种丰富度和均匀度。各组检测出的OTUs 在97%(种)水平上进行划分后将代表序列与数据库注释文件进行对比,结果显示AD 组在粪菌移植后6周、10周2 个时间点获得的OTUs 数均减少,与CON 组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。α 多样性反映的是单个样本内微生物群落的丰富度和多样性,Shannon 指数大、Simpson 指数小表示肠道菌群多样性强,ACE 和Chao1 指数大表示菌群丰度高。AD 组粪菌移植后6周、10周的Shannon 指数 均 降低(P＜0.05,P＜0.01),Simpson 指数均升高(P＜0.05,P＜0.01);ACE 指数、Chao1 指数在粪菌移植后6周、10周的数值均降低(P＜0.05),与CON 组比较差异有统计学意义(见表2)。

表2 模型组与对照组肠道菌群α-多样性指数分析结果(±s)Table 2 Comparison of the α-diversity indexes of gut microbiota between the CON and AD groups(±s)

表2 模型组与对照组肠道菌群α-多样性指数分析结果(±s)Table 2 Comparison of the α-diversity indexes of gut microbiota between the CON and AD groups(±s)

注:与对照组比较,∗P＜0.05,∗∗P＜0.01。Note. Compared with the control group, ∗P＜0.05,∗∗P＜0.01.

组别Groups OUTs Chao1 Shannon Simpson ACE造模6周6 weeks after gavage造模10周10 weeks after gavage造模6周6 weeks after gavage造模10周10 weeks after gavage造模6周6 weeks after gavage造模10周10 weeks after gavage造模6周6 weeks after gavage造模10周10 weeks after gavage造模6周6 weeks after gavage造模10周10 weeks after gavage对照组Control group 343.00 ±97.50309.30 ±72.70484.19 ±32.15416.52 ±71.044.10 ±0.784.02 ±0.650.86 ±0.170.90 ±0.13497.62 ±82.29440.60 ±95.24模型组AD group 878.20 ±105.10551.80 ±142.221024.18 ±106.39685.61 ±99.415.48 ±0.454.37 ±0.710.91 ±0.120.77 ±0.111015.02 ±116.42695.87 ±109.17 P 0.0001∗∗ 0.1192 0.0002∗ 0.0944 0.0484∗ 0.8912 0.7814 0.0747 0.0003∗∗ 0.1141

2.2.2 肠道菌群在科和属水平上的构成

在科水平,造模2 个时间点AD 组拟杆菌科丰度升高(P＜0.01,P＜0.05,图2A),与CON 比较差异有显著性。毛螺菌科(P＜0.001,图2B)、消化链球菌科(P＜0.01,图2C)丰度降低,与CON 比较差异有显著性。

在属水平,造模2 个时间点AD 组拟杆菌属丰度升高(P＜0.01,P＜0.05,图3A),与CON 比较差异有显著性。梭菌属(P＜0.01,P＜0.05,图3B)、毛螺菌属(P＜0.01,P＜0.0001,图3C)、寄生菌属(P＜0.01,P＜0.001,图3D)丰度降低,与CON 比较差异有显著性。

2.2.3 UPGMA 聚类树和主坐标分析

UPGMA 聚类树是根据加权Unifrac 或非加权Unifrac 距离将距离最小的样本聚在一起,形成一个新的聚点,通过不断将聚点进行聚集,获得聚类树。比较2 组的UPGMA 聚类结果:AD 组、CON 组在移植后6周、10周时的加权Unifrac 距离分别为0.732、0.751,表明AD 组与CON 组在菌群丰富度多样性方面存在明显分离,差异有统计学意义(P＜0.05,图4A)。基于加权Unifrac 距离的主坐标分析结果显示,粪菌移植后CON 组、AD 组肠道菌群分布在不同区域,组间分离明显。而同组不同时间点的菌群群落则分布在相同区域甚至互相重叠,聚合较好。(图4B)。

2.3 血液及脑中Aβ 含量

AD 组小鼠在建模10周时血液和脑中Aβ40 含量升高(P＜0.05,P＜0.01,图5A,5C),与CON 组比较差异有显著性。血液和脑中的Aβ42 含量在两个时间点均未见差异有显著性(图5B,5D)。

图2 肠道菌群在科水平上的构成Note. Compared with the control group, ∗P＜0.05,∗∗P＜0.01,∗∗∗P＜0.001. (The same in the following figures)Figure 2 Relative abundance of the bacteria in gut microbiota at family level in the CON and AD groups

2.4 细胞因子检测

检测结果显示,与老年斑形成相关的细胞因子中,IL-1β 在建模6周时浓度降低(P＜0.05,图6A);IL-10 在建模6周时浓度升高(P＜0.01,图6B);TGF-β 在建模10周时浓度降低(P＜0.01,图6C),与CON 组比较差异有显著性。IL-6、IL-33、TNF-α 在建模6周和10周时差异均无统计学意义(图6D、6E、6F)。

2.5 组织病理学结果

在造模的2 个时间点,CON 组(图7A,7C)和AD 组(图7B,7D)小鼠脑内均未观察到有老年斑生成。

3 讨论

已有多篇文献报道人类肠道菌群可在无菌大、小鼠体内定植,其肠道菌群构成保持了人肠道菌群的特征,在肠道细菌数量、代谢速率和酶活性等方面与人体内菌群相似[11-13]。大小鼠体积小,相对经济,更适于进行日益增长的肠道微生态与疾病相关研究的需求。国内外大量报道的啮齿类人源化动物模型以小鼠为主,应用于肠道菌群与疾病关系、肠道菌群对免疫系统影响、益生菌益生元的安全性有效性评价等研究中[14-16]。但针对阿尔茨海默症建立的人源化动物模型国内还未见报道。

根据Hazenberg 等[17]、Che 等[18]的研究结果和本课题组前期建立冠心病HFA 小鼠的经验[9],本研究选择经口途径接种志愿者粪便菌悬液建立小鼠模型,在建模6周、10周时收集小鼠的新鲜粪便、血液、脑组织样本检测菌群结构丰度、细胞因子、老年斑生成等指标。α-多样性分析结果显示,AD 组的Shannon 指数在粪菌移植后6周、10周两个时间点均降低(P＜0.05,P＜0.01),而Simpson 指数均升高(P＜0.05,P＜0.01)。Shannon 指数大、Simpson 指数小表示肠道菌群的多样性强,结果提示AD 模型组小鼠肠道菌群多样性降低。在科和属的水平,拟杆菌科和拟杆菌属的菌群丰度显著升高,与文献报道[19]的人的结果一致。β-多样性分析结果显示CON 组和AD 组小鼠的Weighted Unifrac 距离组间明显分离,差异有显著性(P＜0.05)。CON 组、AD组小鼠组内建模后不同时间点菌群群落分布在同一象限,聚合较好。而2 组间菌群分布在不同区域,表明志愿者肠道菌群在无菌小鼠体内定植,且模型组、对照组小鼠肠道的微生物区系存在明显差异。

图3 肠道菌群在属水平上的构成Figure 3 Relative abundance of the bacteria in gut microbiota at genus level in the CON and AD groups

图4 β-多样性分析结果Figure 4 β-diversity analysis of the CON and AD groups

图5 血清和脑内Aβ 含量检测结果Figure 5 Detection of the Aβ level in serum lipid and brain in the CON and AD groups

图6 细胞因子检测结果Figure 6 The serum levels of cytokines in the CON and AD groups

图7 脑内老年斑检测Figure 7 Histopathological changes in the brain of the CON and the AD groups

据文献报道,AD 患者肠道微生物变化与慢性神经炎症相关。由促炎分子引发的神经炎症引起血脑屏障的通透性增加,炎症反应加重,最终导致胶质细胞增生及神经元丢失[20-22]。拟杆菌属是革兰氏阴性菌,脂多糖是其外膜的主要成分,可引发全身性炎症并促进促炎细胞因子的释放。脂多糖还与与AD 病理学相关,当与Aβ 肽共孵育时脂多糖可增强淀粉样蛋白原纤维形成。在动物中全身注射脂多糖可增强小胶质细胞活性,促炎细胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平增加,引起淀粉样蛋白沉积和tau 相关病理学改变[23]。但AD 是一种复杂的慢性退行性疾病,衰老、遗传、外周病变和环境因素都可能成为其诱发因素。本研究通过经口粪菌移植方式建立了阿尔茨海默症HFA 小鼠模型,模型小鼠的肠道菌群结构与丰度出现了与患者类似的改变,拟杆菌属丰度显著增加,可用于菌群与AD 关系、相关微生态制剂评价等。但相关炎症因子、血液及脑内Aβ 含量等并未出现有统计学意义的改变,需要结合遗传、衰老等因素做进一步研究。